이 비디오에서는, 우리는 CD40 - 활성화 및 면역의 유도를 연구하는 모델 항원 제시 세포 (APC)로 사용할 수 있습니다 C57BL / 6 마우스 splenocytes에서 murine B 세포의 확장 프로 시저를 보여줍니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
B 세포에 관한 연구는 CD40 활성화들은 항원 프레 젠 테이션 능력을 향상하는 것으로 나타났습니다. 인터루킨 - 4 및 CD40 리간드 (CD40L)와 자극을 때, 인간의 B 세포는 고도로 순수 CD40 - B 세포 (매우 큰 금액을 14 일 이내에 말초혈 소량의 어려움없이 확장 가능> 10
프로토콜
splenocytes에서 murine CD40 - 활성화된 B 세포 (mCD40B)의 생성을 위해 프로토콜은 두 부분으로 나누어져있다 : 부품으로 사용됩니다 판 - 헬라 세포 (tmuCD40L 헬라)를 표현 murine CD40 리간드 (CD40L)의 준비를 보여줍니다 피더 세포를 바운드. 파트 B는 실제 murine CD40 - B 문화를 설명합니다.
피더 세포의 A. 준비 (tmuCD40L 헬라)
tmuCD40L 헬라 완전히 합류가해서는 안 자기편 인간 상피 세포주이다. 세포 따라서 주당 두번 splitted 수 있습니다. 6 개 이상 주 동안 Culturing하지 않는 것이 좋습니다.
- 멸균 피펫으로 기본 문화 올드 미디어를 제거하고 1X PBS의 10 ML과 세포를 씻으십시오. 세척 후 PBS를 대기음.
- 37 10-15분에 75cm 2 플라스크에 1X 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 ML 추가 ° C. 세포를 분리하기 위해 부드러운 도청을 사용합니다.
- 야생 유형 매체 10 ML을 추가하고 트립신과 소화를 중지 부드럽게 회전.
- 멸균 피펫과 50 ML 튜브에 세포 현탁액....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜의 수정은 특히도 murine CD40가 활성화된 B 세포의 효율적인 세대에 항복, CD40 - 자극 및 사용 마우스 변형의 유형의 기원에 대해 가능합니다. 아마디 외. CD40 - 리간드와 transfected murine 마우스 섬유아 세포에 대한 유사한 결과를 보여주었다. 외부의 항원이 맞는 프레 젠 테이션에서 확실하게 제외하지만, 보안 및 생체내의 독성에 관한 집중 연구는 인간의 transfected 헬라 세포를 사용하여이 설정에 염증이나 면역 반응 자동에 대한 표지판을 준 수 없습니다. 그러나, 가장 좋은 대안은 우리의 지식을 상업적으로 사용할 수 없습니다 동시에 활동을 활성화하고 proliferating과 CD40 - 리간드 가용성 murine을 나타냅니다.
이 프로토콜은 또한 129S2/SvPas 마우스 (haplotype H - 2B)에서 lymphocytes에 대한 작동하지만, 지금까지 추가로 마우스 종자에 대한 평가되지 않았습니다........
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
실험은 실험실 동물 관리 방법에 대한 국내 및 유럽 지침에 따라 수행되었다. 독일의 동물 복지 법률을 참조하면 동물이 적절한 당국에 의해 정기적으로 제어되었다.
감사의 글
우리는 친절 tmuCD40 - 리간드 - 헬라 세포 라인을 제공 클레멘스 박사 Wendtner 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
미디어 A. 준비 :
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 피더 세포 야생 유형 매체 | 피더 셀 선택 매체 | ||
| 시약 | 집중 | 시약 | 집중 |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L - 글루타민 | 300 μg / ML | L - 글루타민 | 300 μg / ML |
| FBS | 10% | FBS | 10% |
| HEPES | 10 MM | HEPES | 10 MM |
| Gentamycin | 15 μg / ML | Gentamycin | 15 μg / ML |
| Hygromycin B | 0.2 MG / ML |
| mCD40 - B 세척 매체 | mCD40 - B 문화 매체 | ||
|---|---|---|---|
| 시약 | 집중 | 시약 | 집중 |
| D - 멤 | D - 멤 | ||
| L - 글루타민 | 580 μg / ML | L - 글루타민 | 580 μg / ML |
| 포도당 | 4.5 MG / ML | 포도당 | 4.5 MG / ML |
| HEPES | 10 MM | HEPES | 10 MM |
| Gentamycin | 15 μg / ML | Gentamycin | 15 μg / ML |
| 멤 | 0.1mM (1X) | ||
| FBS | 10% |
B. 기타 시약 :
| 시약 | 회사 | 아니오를 주문하지 |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco | REF 21,875 |
| D - 멤 | Invitrogen Gibco | REF 41,965 |
| Dulbeccos PBS (10X) | PAA | 고양이도없는 H15 - 011 |
| Gencin | 델타 선택 | 예술 없음 7,395,800 |
| FBS | LONZA | 고양이도없는 DE14 - 802C |
| HEPES 버퍼 | PAA | 고양이도없는 S11 - 001 |
| 멤 NEAA | Invitrogen Gibco | REF 11,140 |
| Hygromycin B | PAA | 고양이도없는 P02 - 015 |
| 인터루킨 - 4 재조합 Murine | Immunotools | 고양이도없는 12,340,045 |
| 시클 로스 포린 | 노바티스 | 고양이도없는 NDC 0078-0109-01 |
| 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10X) | Invitrogen Gibco | REF 15400-054 |
C. 기타 용품 :
| 시약 | 회사 | 아니오를 주문하지 |
|---|---|---|
| 멸균 피펫 팁 | Sarstedt | |
| 6 - 웰 플레이트 | NUNC | 고양이도 140,675 |
| 50mL 원뿔 관 | BD 팰컨 ™ | 고양이도 352,070 |
| 조직 문화 플라스크 | Sarstedt | 고양이도없는 83.1813.002 |
참고문헌
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
