이 분석은 commissural axons를 방향에 대한 신호 분자의 능력, 여기에 본 Morphogenetic의 단백질 7 (BMP7)을 평가합니다. 배아 등의 척수의 explant는 COS 세포의 secreting 후보 성장 요인의 집계에 인접한 양식입니다. explant 내에서 성장 Reoriented commissural axons은 immunohistochemistry에 의해 시각입니다.
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방법 논문
배아 척수 Commissural Axons을 방향을 Diffusible 신호 분자의 능력을 시금
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
척추 척수 1 도설 commissural axons은 축삭지도 신호를 식별하는 귀중한 모델 시스템을왔다. 여기, 우리는 시험 관내 분석, commissural axons의 방향 2 외부와 내장 신호의 효과를 연구하기 위해 광범위하게 사용되고 있습니다 "reorientation 분석"에 대해 설명합니다. 에 chemorepellent BMP를 포함하여,이 분석은 제인 다드, 토마스 Jessell와 앤드류 럼즈던의 실험실에서 수많은 사람들에 의해 개발되었습니다 (자세한 내용은 응답을 참조)이 분석의 버전은 주요 축삭지도 분자의 reorientation 활동을 증명하는 데 사용되었다 지붕 판 3,4 및 Netrin1 5 소닉 헤지 호그 (쉬) 척수의 바닥 판에 6 chemoattractive 활동.
척수의 지느러미 3 분의 2로부터 2-3 세그먼트로 구성된 Explants은 배아 일 (E) 11 쥐에서 해부하고 입체 콜라겐 젤 7 양식입니다. E11 등의 척추 explants은 당단백질, Tag1 8 그들 axonal 표현식에서 확인할 수 있습니다 새로 태어난 commissural 뉴런을 포함합니다. 문화 30-40시간 과정 동안 commissural 축삭의 궤도는 생체내에서 볼 비슷한 시간 코스 이들 지느러미 explants에 recapitulated 있습니다. 이 axonal 탄도는 테스트 조직이나 지느러미 explant의 측면 가장자리 중 하나를 접촉 후보 신호 분자를 표현 COS 셀 집합 중 하나를 배치하여 도전을 수 있습니다. 추가 조직의 주변에 연장 Commissural axons은 내생 지붕 판과 이소성 조직 측면에서 모두 신호의 영향 아래에서 성장합니다. commissural axons 이러한 상황에서 reoriented 아르 정도는 계량하실 수 있습니다. 이 분석을 사용하여 그것은 모두 commissural 궤도 9 직접이 신호의 필요성뿐만 아니라 commissural axons에게 3,4를 방향에 특정 신호의 자족을 확인 할 수 있습니다.
프로토콜
1 부 : Transfected COS 세포 집계의 준비 공중 방울을 사용하여
- 종자 COS - 7 (COS) 35mm 문화 요리 세포. 그들이 제조 업체의 프로토콜에 따라 Lipofectamine2000을 사용하여 세포에 플라스미드 표현의 80 % confluency, transfect 1μg에 도달했을 때.
- 방울 매달려 준비하려면, transfection 미디어를 기음과 1ml 1X의 인산 버퍼 솔루션 (PBS)로 transfected COS 세포를 헹굴. 15 분 동안 효소가없는 세포 분리 매체의 0.5ml로 세포를 처리합니다. 반응을 중지 Opti - 멤 + 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 글루타민 (P / S / G) + 10% 태아 소 혈청 (FBS)의 솔루션의 1ml을 추가합니다.
- 문화 요리의 표면에서 그들을 제거하고 15ml 원뿔 튜브로 전송하는 세포를 씹다. 펠렛 세포에 2000K에서 2 분 동안 회전. Opti - 멤 + 1X P / S / G + 10% FBS의 100μl에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다.
- 접시의 바닥 위에 뚜껑 장소 반전, 35mm 문화 접시 뚜껑의 안쪽에 여러 20μl 방울을 스팟과 세포 집계까지 몇 시간 동안 37 ° C 배양기에서 두십시오.
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토론
이 분석을 수행하는 성공을 결정하는 중요한 요인이 처음이고, 조직이 너무 연장 기간 동안 dispase로 치료해서는 안됩니다, 이러한 치료는 조직이 매우 끈적되고 및 생존 감소가 발생하게됩니다. 둘째, 콜라겐은 완벽하게 준비하는과 최대한 얼음에 보관해야합니다. 이 설정 시작하면 그것은 처리하기 위해 점점 더 어려워 될 것입니다, 핑크 차례 즉. 세는 텅스텐 바늘은 항상 매우 날카로운 보관해야합니다.
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감사의 글
이 프로토콜은 제인 다드, 토마스 Jessell와 앤드류 럼즈던의 연구소에서 개발되었다. 방법은 콜라겐의 척수의 문화 explants에 콘레드 바슬러, 앤 Calof, 토마스 에들런드, 필 해밀턴, Domna Karagogeos, 아리엘 루이즈 I Altaba 및 Toshiya 야마다 등 많은 사람들이 결정. Marysia Placzek과 마크 테시어 - 라빈은 축삭지도 분자를 식별하는 수단으로 체외의 explants에서에서 축삭 성장을 사용할 수있는 기술을 개척. 버틀러 실험실에서 작품은 NIH / NINDS에서 천과 R01 NS063999의 3 월부터 기금에 의해 지원됩니다.
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참고문헌
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A.
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재인쇄 및 허가
