방법 논문

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

DOI:

10.3791/1855

⸱

2010년 3월 9일

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Emory University, 2Department of Medicine, Division of Cardiology, Emory University

이 논문에서

요약

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세포 투과 crosslinker DSP [dithiobis - (succinimidyl 프로피 온산)] 일시적 안정화와 불안 정한 상호 작용 생체내에. 여기 immunoprecipitation에 의해 단백질 단지의 절연 다음 문화의 성장 crosslinking 전지에 대한 기술을 제시한다.

초록

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세포 기계의 동적 특성은 자주 일시적 및 / 또는 약한 단백질 연결에 내장되어 있습니다. 이러한 낮은 친화도 상호 작용 관심의 단백질 주변의 분리 및 단백질 네트워크의 식별에 대한 엄격한 방법을 배제. 화학 crosslinkers의 사용은 따라서 정화에 대한 생화 학적 한계를 거치지 않고 불안 정한 상호 작용의 선택 안정화 수 있습니다. 여기에 우리가의 스페이서 팔로 homobifunctional crosslinker를 사용하는 문화의 세포에 대한 의무 프로토콜을 현재 12, dithiobis - (succinimidyl proprionate) (DSP). DSP는 분자에 존재 disulphide 결합의 감소에 의해 죽습니다. 자석 구슬과 관심의 단백질의 면역 크로마 토그래피와 결합 가교 달리 정화 견딜 않을 단백질 단지의 절연을 수 있습니다. 이 프로토콜은 일반적인 서양 얼룩 기술과 호환되며 그것은 대량 분석법 1 단백질 식별을 위해 확장할 수 있습니다.

스테파니 A. Zlatic와 진주 V. 라이더이 작품에 동일하게 기여.

프로토콜

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1. Crosslinking 준비

  1. 당신은 표준 튜브 반응 당 단백질 500 μg의 고립을 허용 접시에 세포의 충분한 번호가 필요합니다. 하나의 튜브가 immunoblot으로 관심의 단백질 putative interactors의 식별하기에 충분한 수 있습니다. 이 경우 비드 바운드 자료는 SDS - PAGE 샘플 버퍼 (immunoprecipitation)로 eluted 수 있습니다. 질량 분광법의 분석을 위해, 표준 반응의 숫자는 적어도 10 배 증가되어야하며 단백질 단지는 (면역 친 화성 크로마 토그래피) 사용 항체에 의해 인식 펩타이드 항원과 함께 밖으로 경쟁에 의해 eluted해야합니다. 이 전략은 면역 글로불린 무료 단백질 단지의 격리를 허용합니다.
  2. crosslinking에 대한 최적의 세포 밀도가 75 % confluency 90% 사이입니다. 높은 confluency 조건에서, 세포는 모든 세포에 세포 투과 crosslinker에 접근을 감소하는, 서로에 대한 더미하는 경향이있다.
  3. 세포 종류와 실험 조건은 셀 플레이트의 하단에 표시해야합니다. 우리는 일상적으로 혼자 자동차와 컨트롤을 포함합니다.
  4. 이전 crosslinking에 DSP 솔루션을 제외한 모든 솔루션을 준비합니다.
    1. CaCl

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토론

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DSP, 멤브레인 - 침투성, 12의 스페이서 암과 화학적 줄이할 수있는 crosslinker는 과도 단백질 상호 작용 1,2,3,4를 안정화하는 데 사용됩니다. 여기서 우리는 어댑터 복잡한 AP - 3 5 endosomes에서 vesicles에 막 단백질을 인식하고 각종 가용성 단백질 복합이 전략을 exemplified. AP - 3 선택 아연 수송 ZnT3 및 지질 키나제 phosphatidylinositol - 4 - 키나제 타입 II 알파지만 트랜스페린 수용체 1,4,6에 바인딩합니다. 우리는 대량 분석법 1 막 단백질과 cytosolic 요인 AP - 3 단백질 상호 작용 네트워크의 식별 이러한 관찰을 확대. 낮은 배경 단백질 마그네틱 강수량은 상호 작용하는 단백질을 확인하기 위해 crosslinking을 따릅니다. 또한 비 선택적으로 자석 구슬에 바인딩 단백질의 출판 카탈로그 질량 분석계 7 비 특정 단백질 분리 및 식.......

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감사의 글

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이 작품은 VF에 국립 보건원 (NS42599 및 GM077569)에서 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인산염 완충 식염수InvitrogenP4417200mL 물에 용해시키고 최종 농도 1mM에 MgCl2를 추가하고 최종 농도 0.1mM에 CaCl2를 추가합니다
.22585수분 민감성, 밀폐 용기에 보관 4° C
디메틸 설폭 사이드 (DMSO) Hybri-MaxSigma-AldrichD2650
Triton X-100, SigmaUltraSigma-AldrichT9284
Dynabeads, Sheep anti-Mouse IgGInvitrogen110.31Beads are also available as sheep anti-rabbit
Dyna-Mag-2 magnetInvitrogen123-21D
1정을

참고문헌

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  1. Salazar, G. Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells. J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).
  2. Lomant, A. J., Fairbanks, G.

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Protein Cross LinkingImmuno Magnetic AffinityDSP CrosslinkerImmunoprecipitationWestern BlotMass SpectrometryCell LysisProtein Complex IsolationLabile Protein InteractionsControlled Cellular Cross Linking

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