알츠하이머병 중 하나는 기능은 Aβ의 상승입니다 1-42 펩타이드. 여기 합성 Aβ를 준비를위한 프로토콜을 제공합니다 1-42 oligomers는, 세포의 메모리 상관 관계. 이 절차는 Aβ 유발 병리학 및 약물 검사의 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
시냅스 연결의 장애가 알츠하이머 병 (AD)의 초기 단계에서 발생하는 미묘한 amnesic 변경 사항을 기초로 가능성이 높습니다. β - 아밀로이드 (Aβ), AD 높은 금액에서 생산되는 펩티드는 세포가 학습과 기억의 상관 관계를 장기 Potentiation (LTP)을 감소시키는 것으로 알려져 있습니다. 사실, Aβ에 의한 LTP 장애는 AD 모델과 같은 신경 손상을 완화하거나 되돌리는 능력 심사 약물에 대한 신경 장애를 공부에 유용한 실험 패러다임이다. 연구 Aβ는 oligomeric 양식을 통해 우선적으로 LTP 장애를 생산하는 것으로 나타났습니다. 여기 oligomerized 합성의 재관류에 의해 급성 hippocampal 조각에 Aβ1 - 42 펩타이드를 혼란 LTP에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 비디오에서는, 우리는 oligomeric Aβ의 준비를위한 단계별 절차를 설명합니다
프로토콜
Resuspending β - 아밀로이드 펩타이드
시작하기 전에 준비했습니다 :
- Aβ 1-42 (동결 건조된 분말)
- 1,1,1,3,3,3 - Hexafluoro - 2 - 프로파놀 (HFIP)
- 낮은 결합 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 튜브 (1.5 ML)
- 테플론 동작 정류장 (250 μl)와 GasTight 해밀턴 주사기
- Dimethylsulfoxide (DMSO)
- 동결 건조된 Aβ 1-42은 펩타이드 병을 열 때 응축을 피하기 위해 30 분 실온에서 평형 수 있습니다.
- 펌 후드 아래, 1 MM 솔루션과 몇 초 동안 와동 솔루션을 얻기 위해 추운 얼음 HFIP에서 Aβ 1-42 펩타이드를 다시 일시 중지합니다.
- 테플론 플러그와 유리 GasTight 해밀턴 주사기를 사용하여 신속하게 동일하게 세 폴리 프로필렌의 튜브에 Aβ 1-42 / HFIP 솔루션을 분할하고 튜브를 밀봉.
- 튜브는 다음 Aβ monomerization 수 있도록 2 시간 incubated 수 있습니다. 다....
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토론
위에서 설명한 바와 같이, oligomeric Aβ의 준비에 몇 가지 문제가 손상되지 않은 LTP가 발생할 수 있습니다. Aβ 열화 또는 Aβ oligomerization의 부족이 발생했을 수 있는지 여부를 평가하는 한 가지 방법은 트리스 - Tricine 페이지 웨스턴 / 모래 바닥 분석 및 분석 ultracentrifugation (이 프로토콜에서 설명하지 않은)를 사용하여 Aβ 준비를 평가하는 것입니다. 서양 모래 바닥 샘플 non-denaturing/non-reducing 조건 하에서 준비가되면, 성공적인 준비 단량체와 다른 oligomers 3에 해당하는 대역을 갖춘 서양 모래 바닥 서명을 생성한다. 자주 발생하는 문제는 SpeedVac 농축기에서 건조 단계에서 펩타이드 불안정성이다. 사실, 고온 건조는 갈색으로 표시 펩타이드의 착색에 의해 눈에 띄게, 단백질 저하로 연결됩니다. HFIP 솔루션의 농도는 신중하게 상온에서 실시하고 모니터링할 수 있습니다. 프로토콜에서 발생 몇 가지 절차적 단계를.......
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공개 사항
동물 실험은 컬럼비아 대학 IACUC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
감사의 글
이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중 NIH 국립 연구소 (NINDS) (NS049442)에 의해 지원되었다.>
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Aβ 1-42 (동결건조) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL 폴리프로필렌 원심분리관 | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear 마이크로튜브 Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| 인산염 완충 식염수 (Phosphate-Buffered Saline) pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT 주사기 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| 배스 초음파 세척기 (Bath sonicator) | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac 농축 시스템 | Various | SC 110A |
참고문헌
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V.
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재인쇄 및 허가
