우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
전송 전자 현미경 (TEM)은에서 중추 신경계에 microglial, oligodendrocytic astrocytic와의 연결을 subcellular 구획 (dendrite, 돌기 척추, 축삭, 축삭 터미널, perikaryon),뿐만 아니라 자신의 세포 organelles과 cytoskeleton을 시각화를위한 매우 유용합니다 높은 공간 해상도. 로 표시, TEM과 결합하여, 사전 퍼가기의 immunocytochemistry는 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준 (예, microglial perikarya 및 프로세스, microglia 특정 마커 Iba1 (이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 하나에 대한 항체를 사용하는 경우와 세포 요소의 차별을 허용 여기에)), 신경 전달 물질의 세포 요소의 내용 (예 : serotonergic) 및 ultrastructural 가용성이나 멤브레인 - 바운드 단백질의 지방화 (예 : 5 HT1A 및 EphA4 수용체)를 식별. 여기, 우리는 acrolein 정착액, 뇌 섹션의 sectioning 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라 immunoperoxidase - diaminobenzidine (DAB) 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin와 생쥐의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 TEM과 시험 준비가되었습니다. 엄격하게 수행하는 경우,이 기술은 최적의 ultrastructural 보존과 immunocytochemical 검출 사이 좋은 타협을 제공합니다.
프로토콜
1. 동물 재관류
- 재관류 전날에 준비 :
- 인산염 버퍼 2 패 (PB, 100 MM, 산도 7.4) 및 나트륨 1 L 인산염 버퍼 호수 (PBS를, 0.9 % 50 MM PB에 NaCl, 산도 7.4)을 두 번 증류수 인치 4 PB의 PBS와 1L ° C.를 저장 이들은 재관류 및 사전 삽입의 immunocytochemistry에 사용됩니다.
- 6 생쥐의 재관류를 가능하게 4.0 %의 paraformaldehyde의 1L (PFA, 산도 7.4) 정착액 솔루션. 그 목적을 위해, 가열 퓸 후드 아래에 PB 1 패 있습니다. 세분화된 paraformaldehyde (PFA)의 40g의 무게를하고 60 ° C.에 도달하면 PB 솔루션에 따르다 솔루션은 4 실온 (RT)과 저장하는 시원한 PFA 완전히 용해, ° C.으로 명확하면 - 재관류의 날, 퓸 후드 아래의 PB에 3.5 %의 acrolein 솔루션 500 ML을 준비합니다. 그런 다음, 3.5 % acrolein와 필터 용지를 사용하여 4.0 % PFA 솔루션을 필터링합니다.
- 마우스 마취 들어, 27 게이지 ½ "바늘과 복막에 (80 MG / kg) 나트륨은 pentobarbital 주입.
- 재관류 동안, PBS 50 ML은 acrolein의 75 ....
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토론
여기 우리는 최적의 ultrastructural 보존 및 절차 엄격하게 수행됩니다 immunocytochemical 감지, 사이 좋은 타협을 제공 immunoelectron 현미경에 대한 마우스 뇌 조직의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다.
TEM과 결합,이 방법은 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준으로 세포 요소를 구분할 수 있습니다. 특히, Iba1의 immunoperoxidase - DAB의 얼룩은 neuropil 내에 microglial perikarya 및 프로세스를 식별하는,뿐만 아니라 형태, 세포 organelles 및 기타 휴대 요소 (그림 3-6)와 ultrastructural 관계를 분석할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 ultrastructural glial이나의 연결 요소에 용해 또는 멤브레인 - 바운드 단백질의 위치뿐만 아니라 세포 organelles 그들의 연관 관계를 분석하실 수 있습니다. 사실, 특정 항체이 프로토콜을 사용하여, 우리는 이전에 5 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 기술 지원을 위해 로체스터 의료 센터의 대학의 전자 현미경 연구의 핵심 시설에 연동 펌프와 vibratome의 사용뿐만 아니라, 카렌 L. 벤틀리와 게일 슈나이더에 대한 Shao - 명나라 루 해리스 A. Gelbard 감사합니다. 이 작품은 NIH (EY019277), 화이트홀 재단, 버로우즈 웰컴 기금과 AKM에 알프레드 P. 슬로안 재단의 기금에 의해 투자되었다. M.-È.T. 퐁 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ) 박사 교육 수상에 의해 후원됩니다.
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재료
* 하나는 항상 퓸 후드 아래의 작업과 acrolein, paraformaldehyde, 그리고 오스뮴 처리 또한 적절하게 자신의 폐기물의 처분해야 할 때 nitrile 장갑을 착용해야합니다.
참고문헌
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin ....
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재인쇄 및 허가
