비교적 생체내에 학습 Xenopus laevis</em

요약

개구리 Xenopus laevis 항원에 특정한 CD8 T 세포 응답을 촉진하기 위해 gp96로 열 충격 단백질의 기능을 탐험에 대한 매력적인 대안이 아닌 포유 동물 모델을 제공합니다. 우리는 방법을 연구 제시 생체내에 촉진.

초록

우리는 수륙 양용 Xenopus의 개발은 chaperoned 항원의 교차 프레 젠 테이션을 촉진하고 타고난 및 적응 T 세포 반응을 이끌어내는 수 있습니다. Xenopus 피부 이식 거부와 같은 gp96와 같은 특정 열 충격 단백질 (hsps)의 능력을 연구하기위한 독특한 아닌 포유 동물 모델을 laevis 고전 MHC 클래스 구이 (클래스 구이) 제한 T 세포 반응을 이끌어내는 위해 gp96의 능력을 연구하는 뛰어난 플랫폼을 제공합니다. 또한, Xenopus 모델 시스템은 또한함으로써 면역 감시를 탈출 자신의 클래스 구이 분자를 아래로 조절이 종양에 대한 응답을 생성하는 gp96의 능력을 탐험 마우스에 대한 매력적인 대안을 제공합니다. 최근, 우리는 항원 제시 세포 (APCs)로 복막 leukocytes를 사용하여 Xenopus 클론에서 입양 세포 전송 분석을 개발하고, 같이 가지고 가벼운 histocompatibility 피부 항원에 대한뿐만 아니라 Xenopus thymic 종양 15에 대한 생체내에 gp96 수있는 최고급 CD8 T 세포 응답 클래스 구이 분자를 표현하지 않습니다 / 0. 우리는 여기서 복막 leukocytes의 이끌어 냄, pulsing과 입양 전송뿐만 아니라 피부 이식 및 종양 이식 assays 포함하여 이러한 assays을 수행하기 위해 관련된 방법론을 설명합니다. 또한 우리는 유동세포계측법 피부 제거 및 안티 종양 반응에 관여 효과기 인구의 자세한 특성화를 허용 확산 assays에 사용되는 주변 혈액 leukocytes의 수확과 분리를 설명하고 있습니다.

프로토콜

1. 동물

X. laevis X X. gilli 하이브리드 LG - 6와 LG - 15 isogenetic 클론 ¹ 로체스터 (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm)의 대학의 번식 식민지에서입니다. LG - 6와 LG - 15 공유 같은 heterozygous MHC haplotype (A / C)하지만 사소한 histocompatibility (H) loci에서 다릅니다. 이 클론의 자손은 여성에 의해 만들어진 diploid 달걀은 UV - 조사 정자 (자손없이 DNA 기여)에 의해 활성화하는, gynogenesis에 의해 생산됩니다.

장갑의 사용은 통성 있습니다. 어떤 사람은 개구리를 처리하기 어렵습니다 (미끄러)와 사실 그것은 개구리 불편하게 만드는 나타나기 때문에 그들을 착용하지 선호합니다.

2. 15 / 0 종양 (종양 및 H - AGS 마이너를 모두 표현)의 gp96의 정화

Gp96 정화는 이전에 다음 ID로 ^{2, 3을} 설명하고 있습니다. 간단히, gp96는 코나 - 세파 로스와 DEAE 크로마 토그래피 다음 50~70%의 암모늄 황산 분별 (분리)로 정화됩니다. 단백질의 약 20-50 μg는 종양 조직의 1 ML 당 얻을 수 있습니다. 준비 순도는 SDS - PAGE와 은색 염색법에 의해 결정됩니다.

3. 마이너 H - AG - 이질 LG - 6 프로그에서 복막 Leukocytes (PLS)의 이끌어 냄과 추수

1. 25 ML 하루 E. 그로 37 50 ML 원뿔 관에서 대장균 문화 ° 잡고 C.
2. 다음날 열은 1 시간 동안 그것을 끓는하여 박테리아를 죽일.
3. E.을 죽인 열을 원심 분리기 4 2,000 RPM (1,500 G) ° C. 15 분 대장균
4. 뜨는을 제거 1 / 10 ^일 APBS에서 원래 문화 볼륨 (2.5 ML)의 박테리아 펠렛을 resuspend. 이 시점에서 세균성 문화 사용할 수 있습니다 24 시간 이내에 사용하셔야합니다.
5. intraperitoneally (IP) 200 (2 인치 개구리의 경우) 또는 25 게이지 8분의 5 바늘을 사용하여 개구리 당 열 죽이고 박테리아 준비 300 μL를 (3 인치 개구리)을 주입.
6. 사출 PLS 후 3 일이 intraperitoneal 세척하여 수확하고 있습니다.
7. 모든 운동 (기간은 크기와 연령에 따라) 중단까지 PL의 수확하기 전에, 성인 개구리는 최대 5 분하는 나트륨 중탄산염와 버퍼 tricaine의 메탄 설 폰 산염 (TMS, MS - 222)의 0.1 % 수용액에 침지하여 anesthetized 있습니다. 동물 치료 후 10-20 분 이내에 일어나.
8. 70 % 에탄올을 소량으로 개구리의 복부를 소독.
9. 5 ML (2 인치 개구리의 경우) 또는 멸균 APBS 18 게이지 1 ½ 바늘을 사용하여 복막 캐비티에 실온에서 사전 예열 10 ML을 (3 인치 개구리)을 주입. 바늘을 제거하고 부드럽게 주입 버퍼가 뱃속에있는 액체와 equilibrates 것을 막기 위해 잠시 동안 개구리를 마사지.
10. 깨끗한 50 ML 원뿔 관에 바늘 뒤쪽에서 똑됩니다 복막 유체를 수집하는 주사기없이 새 18 게이지 1 ½ 바늘을 사용합니다. 가능한 한 초기 주입 볼륨의 많은를 검색할 수 있는지 확인하십시오. 복부 지역의 중심 지역에 혈관을 피하기 위해주의하십시오.
11. 그것은 그 새장에 다시 삽입할 수있는 지점에 깨어 때까지 일단 PLS는 얕은 물로 용기에 개구리를 넣어 수확하고 있습니다.

4. 나이브 LG - 6 수신자으로 LG - 6 PLS의 Pulsing 및 입양 전송

1. 감기 APBS로 번 PLS를 씻어 4 10 분 ° C. 1,000 RPM (750g)에 그들을 원심 분리기
2. 뜨는를 제거하고 APBS의 PLS를 resuspend.
3. 5 X 10 ⁵ PLS 당 1 μg gp96의 농도에 gp96와 PLS를 펄스.
4. gp96의 적절한 금액은 PLS에 추가되면, 1 시간 동안 얼음에 pipeting와 부화하여 그들을 섞는다.
5. 어떤 언바운드 gp96를 제거하는 4 10 분 1,000 RPM ° C에서 또는 1 분 14,000 RPM에서 두 세포를 원심 분리기.
6. 여운 gp96 남아가 없습니다 않도록 추위 APBS와 배 PLS 씻으십시오.
7. 300 μL 당 5 X 10 ⁵ PLS의 농도에서 펄스 PLS를 Resuspend.
8. Adoptively 25 게이지 8분의 5 바늘을 사용하여 IP 주입하여 PLS를 전송. 동물마다 펄스 PLS (5 X 10 ⁵ 세포) 300 μL를 주입.
9. 개구리 피부 이식이나 종양 과제 실험을 계속하기 전에 최소 3 일 끝났다해야합니다.

5. 피부 이식 분석

피부 이식의 거부는 Xenopus ^{4, 5, 6에서} 잘 확립 분석이다. Xenopus에서,받는 사람은 21-22에서 18~22일 이내에 1 또는 2 MHC haplotype의 불일치를 표시 기증자 피부 ° C. 거부 반면, LG - 6와 가벼운 H - AGS에 의해서만 차이가 LG - 15 클론 사이의 피부 이식은 (30 일 해당) 더 느리게 거부됩니다. 그러나이 거부는 수신자 THA에 가속입니다t은 이전의 피부 이식 또는 기증자로부터 정화 gp96과 예방 접종을 통해 기증자 사소한 H - AGS에 대해 제일 먼저 처리 해달라고했습니다. 전혀 거부는 기증자와받는 사람이 유전자 (복제, 예 또는 전적으로 타고난 동물) 동일 경우 발생하지 않습니다. 따라서,이 간단한 기술은 gp96로 elicited 생체내 면역 반응의 특성화를위한 매우 강력합니다.

1. 로 3.7에 설명되어있는 기증자의 개구리를 마취.
   참고 : Xenopus 총 무균 절차에 대한 필요성을 obviates 피부에 강력한 안티 - 미생물 펩티드 (예 : magainin) 생산 이후에만 최소한의 예방 조치가 이동해야합니다. 사실, 모든 살균제와 개구리의 치료는 피부에 해로운 것입니다. 또한, Xenopus은 인간에게 전송할 수있는 병원균이 없습니다. 따라서, 장갑의 사용은 선택 사항입니다. 그러나, 사용되는 모든 해부 악기는 autoclaved해야 할 모든 솔루션을 살균해야합니다.
2. 가위를 사용하여 LG - 15 기증자 개구리의 복부 피부의 조각 (때문에 irridophore 색소 세포의 존재에 은빛 나타나는 복부 피부) (X 5mm를 20mm) 잘라 작은 제거합니다.
3. Petridish 포함 APBS의 피부를 삽입하고 얼음에 보관하십시오. 아주 부드럽게 피부 조직을 조작, 포셉 사이에 그것을 들고 마십시오.
4. 면도칼이나 가위를 사용하면 5mm로 X 5mm의 조각 개별 이식 잘라. 얼음 APBS의 조각 보관하십시오.
5. 그것은 항생제를 (5 MG / L의 농도에서 Penstrep)가 포함된 물에 배치됩니다 깨어 후 때까지이 시점에서 기증 개구리는 얕은 물로 용기에 배치됩니다. 개구리는 그것이 일반 물에 반환되는 시점에 이틀 동안 항생제와 함께 물 속에 보관됩니다. 피부가 제거된 사이트에 작은 상처가 달고 다니는해야하며 일주일 이내 치유되지 않습니다.
6. 받는 LG - 6 개구리를 마취.
7. 받는 사람의 지느러미 (다시) 피부에 작은 절개를 만들고 은색 면을 피부 아래의 5mm X 5mm 그래프트를 삽입합니다. 그 변위 또는 이식의 손실로 이어질 수 있기 때문에 피부 아래의 대형 공기 방울을 소개하지 않도록주의하십시오.
8. 채점이 시작되면 이들은 이식 거부 반응으로 계산하지 않기 때문에 당신이 이식에 가위와 집게 표시를 참고 있는지 확인하십시오.
9. 24 시간 후에 오버레이 호스트 피부의 일부가 이식에서 제거되어야합니다.
10. 받는 LG - 6 개구리를 마취. 5.1에서 설명한대로 동물을 취급하고 있습니다.
11. 이식 자유롭게 시각 수 있도록 autoclaved 가위를 사용하면 이식 주위에 창 밖을 잘라 버릴거야. 기증자 피부를 만지거나 출혈을 유발하지 않도록주의하십시오. 5.5에서 설명하는 것처럼 개구리는 회복하자.
12. 스케치를 취하여 바로 그래프트를 채점 시작합니다. 피부 이식의 거부는 이식할 피부 irridophores 파괴의 비율에 의해 결정됩니다.
13. 이식 2-3 일마다 검사해야하지만 동물이 일을 anesthetized 될 필요가 없습니다. 이식을 시각화하기 위해 개구리 해부 현미경 petridish에 배치해야합니다.

6. 이식 피부의 전체 마운트 Immunohistology

프로그 전체 - 마운트 immunohistology는 이전에 다음 ID로 ⁶ 설명했습니다. 간단히, 개구리 anesthetized와 개구리 물 (작업 공간도 무균 준비)로 사전에 젖은 멸균 종이 타월에 현미경으로 배치됩니다. 이식 피부가 다음 호스트 피부 주변의 작은 금액을 함께 수확하고 있으며 그것은 유동세포계측법 분석 ⁶ 셀 얼룩 비슷하게 항체 물들일 것입니다. Autoclaved 악기 및 살균 버퍼는 사용해야합니다. 피부 얼룩 후 현미경 슬라이드에 배치하고 부드럽게 커버 전표와 함께 누르면. 이 시점에서 피부 이식을 침투가 다른 세포 집단을위한 형광 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 섹션 5.5에서 설명한대로 절차 후 개구리는 항생제로 물에 유지됩니다. 와 일반 물에 돌아왔습니다. 피부가 제거 어디에 왼쪽으로 작은 상처가 일주일 이내 깨끗하 데요.

7. 혈액 Leukocytes의 특성화

1. 개구리의 혈액을 제거하기 전에, 하나 이상의 멸균 화염 파스퇴르 pipettes를 당기는하여 "유리 바늘"을 준비해야합니다. 피펫의 벌금 끝단은 stereomicroscope 아래 날카롭게입니다. 피펫은 다음 열망 플라스틱 튜브에 연결되어 있습니다.
   같은 포셉 및 가위 등 모든 악기 사용하기 전에 autoclaved해야합니다.
2. 또한 APBS 1 ML 당 헤파린 50 단위를 추가하여 APBS과 헤파린 솔루션의 얼음 차가운 10 ML을 준비합니다. 얼음 솔루션 보관하십시오. 사용된 모든 솔루션 살균해야합니다.
3. 3.7에서 설명한대로 개구리를 마취하고, 같은 5.1에서 설명한 동일한 동물 처리 절차를 따르십시오. .
4. 노출에 대한 사후 발 위에 피부를 잘라지느러미 족근의 정맥.
5. APBS + 헤파린 용액 1-2 ML과 파스퇴르 피펫을 입력합니다.
6. 정맥에 "유리 바늘"을 넣고 천천히 입으로 aspirating하여 혈액을 수집 시작합니다. 이것은 혈액 응고와 바늘의 팁을 막히는에서 혈액을 방지하기 때문에 그것은 "유리 바늘"에 APBS + 헤파린 솔루션을 가지고하는 것이 중요합니다.
7. 혈액 1 ~ 2 ML 하나의 평균 크기의 개구리에서 얻을 수 있습니다.
8. 개구리 다리에있는 작은 절개는 꿰매 필요하지 않으며 상처가 일주일 이내에 치유.
9. 4 10 분 1,000 RPM에서 혈액을 원심 ° C.
10. 뜨는를 제거하고 차가운 APBS 10 ML과 1X 세포를 씻으십시오.
11. ficoll Histopaque 1.077 (시그마)는 적혈구에서 혈액 leukocytes을 구분하기 위해 상온에서 사전 예열 1 ML에 혈액의 중첩이 ML (1-5 X 10 ⁶ 세포).
12. 없이 브레이크와 함께 상온에서 1,000 rpm으로 20 분 원심 분리기 다음 백혈구 밴드를 수집합니다.
13. 4 10 분 1,400 rpm으로 원심 분리에 의해 APBS와 2X 세포를 세척 ° C 잔류 ficoll을 제거합니다.
14. 이 시점에서 세포 유동세포계측법 분석을위한 항체 물들일 준비, 또는 체외 문화 assays에 사용 될 수 있습니다.

8. 종양 이식 분석

1. 약 일주일 새 15 / 0 종양 세포의 배치와 세포가 잘 성장 시작되었는지 확인 밖으로 실험 해동하기 전에. 문화 매체가 간결 다음 섹션에서 ^3에서 자세히 설명되어 있습니다.
2. 15 / 0 종양 세포를 확장합니다.
3. 실험 당일에 세포를 세고 Trypan 파랑 제외 의한 세포 죽음을 결정합니다. 세포 죽음은 5 % 미만되어야합니다. 4 천 rpm으로 추위 APBS에 1X 세포 및 원심 분리기를 씻어 ° C, 10 분.
4. 300 μL 당 5 X 10 ⁵ 15 / 0 세포의 밀도에 종양 배지에서 세포를 Resuspend.
5. 동물의 등의 (뒤쪽) 측면 한쪽에 25 게이지 8분의 5 바늘을 사용하여 피하 주사에 의해 개구리 300 μL 볼륨에 이식 5 X 10 ⁵ 세포.
6. 종양 성장은 종양 도전 후 2-3 주 내에 시작됩니다. 초기 종양의 외관은 주목하고 종양 볼륨 2-3 일마다 기록해야합니다. 종양 부피 (높이 X 길이 X 너비)는 캘리퍼스를 사용하여 측정됩니다.
7. 종양이 3,500mm ³ 커지거나 개구리는 기면 찾고 시작되면, 그것은 불편을 방지하기 위해 euthanized해야합니다.

9. 시약이 필요 :

• 6.6 g / L NaCl, 1.15 g / L 나 ₂ HPO _4, 0.2 g / L KH ₂ PO : 수륙 양용 인산이 살린 (APBS)를 버퍼. 10N NaOH와 필터를 사용 산도 7.5 필터 0.2 μm의를 통해 살균.
• Tricaine의 메탄 설 폰 산염 (TMS, MS - 222) (크레 스 켄트 연구 화학 CAS # 886-86-2).
• 나트륨 중탄산염 (피셔 사이 언티픽 S - 233-500).
• Histopaque - 1077 (시그마 - 알드리치 10771-100 ML)
• 헤파린 나트륨 소금 (시그마 - 알드리치 H3149 - 50KU)
• Xenopus 15 / 0 종양에 대한 문화 매체 [자세한 내용은 3 참조] : 10 ML의 인슐린, 10 ML 아닌 필수 아미노산, 10 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신과 Iscove DMEM 기초 중간 1 L (Gibco - Invitrogen 11,965) 10 μg / Kanamycin의 ML; primatone (셰필드 제품 사업부), β2 - 메르 캅 토 에탄올 1 ML, 그리고 물에 3.02 g NaHCO ₃ (산도 7.0) 3 ML. 이 매체는 30% 더블 증류수를 추가하여 수륙 양용 osmolarity로 희석하고, 5% 태아 소 혈청, Xenopus의 신장 세포 라인 A6에서 20 % superantant, 그리고 정상 Xenopus 혈청의 0.25 %로 보충합니다.

10. 대표 결과

그림 1. 피부 이식 거부 12일 포스트 이식의 Stereomicroscopic 분석. LG - 6 복제 개구리 중 (A) MHC - 동일 LG - 6에서 피부 이식을받은 것은 (아무 거부를 표시하지 않음) 또는 (b) MHC - 이질 outbred 기증자 (80 % 제거). 화살표 건강 (비 거부) 이식할 조직을 표시 은빛 iridophore 색소 세포를 보여줍니다. (*)의 마크는 거절로 인해하지 포셉.

그림 2. Gp96는 Xenopus의 종양 항원의 교차 프레 젠 테이션을 용이하게합니다. LG - 15 PLS (5 × 10 ⁵⁾ APBS (대조군), E.의 정화 재조합 gp96 1 μg과 중 얼음에 1 시간을위한 펄스되었습니다 gp96의 콜리 문화, 또는 1 또는 0.5 μg 15 / 0 종양 조직에서 정화. 3 세척 후, 세포가 adoptively LG - 15 성인 수신자로 전송되었습니다 (1 × 10 ⁶ / 개인). 사흘 후, 15 / 0 종양 세포 (5 × 10 ^{5)되었습니다} 라이브SC 주입하여 이식. 각 곡선 한 개구리의 종양 성장 속도론을 나타냅니다. 종양이 처음 출현 일 게시 도전 모니터링했고, 종양 크기는 캘리퍼스 (길이 X 폭 X 두께)를 주기적으로 결정했다.

토론

수륙 양용 Xenopus은 면역력을 공부하는 독특한 다목적 아닌 포유 동물 모델입니다. 생명 의학 및 면역 연구에 광범위한 사용에는 MHC 정의 클론 LG - 6와 LG - 15뿐만 아니라 다른 세포 라인과 단클론 항체와 같은 많은 중요한 연구 도구가 생긴 거죠. 우리가 강력한 AG - 특정 안티 - 사소한 H - AG 및 안티 종양 T 세포 응답 ⁷ 중재하기 위해 gp96로 열 충격 단백질의 기능 연구를 체외에서 생체내 assays에서 다른 설립 이러한 도구를 사용합니다. 이 모델은 시스템은 우리가 더욱 프라이밍 및 효과기 세포 단계에서 gp96 면역 속성을 조사 수 있습니다.

마중물 단계 등 접목 피부 종양 이식 ^{2 8로} 생체내 assays에서 전에 두 주일 간격으로 10 μg gp96의 두 주사 필요한 것을 gp96를 정화와 피하 예방 접종 사용이 반응의 초기 연구에 관한. 비교에서,...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
필요 시약:
양서류 인산 완충 식염수 (APBS):
NaCl, 1.15 g/L
Na2HPO4, 0.2 g/L
KH2PO
10N NaOH
Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
탄산수소나트륨	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100ml
헤파린 나트륨염	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Xenopus 15/0 종양용 배양 배지 [자세한 내용은 3번 참조]:
Iscove DMEM 기본 배지	GIBCO, by Life Technologies	11965
인슐린
비필수 아미노산
페니실린-스트렙토마이신
카나마이신
Primatone	Sheffield Products Division
β2-mercapt–thanol
NaHCO3
30% 이중 증류수
5% 소태아 bovine serum
20% Xenopus 신장 세포주 A6 상층액
0.25% 정상 Xenopus 혈청
재료 및 장비:
50 및 15 ml 원추형 원심 분리 튜브 (멸균)
25 gauge 5/8 Precision Glide 멸균 바늘	BD Biosciences
18 gauge 1½ Precision Glide 멸균 바늘	BD Biosciences
1 ml Tuberculin Slip Tip 멸균 주사기	BD Biosciences
10 ml Slip Tip 멸균 주사기	BD Biosciences
1.5 ml MicroCentrifuge 튜브 (멸균)
60 X 15 mm 폴리스티렌 페트리 접시 멸균	Falcon BD
면도날
25 X 75 mm X 1 mm 프리미엄 현미경 슬라이드	Fisher Scientific
10 cm 유리 페트리 접시
9" 파스퇴르 피펫 Durex 붕규산 유리 면 마개 일회용	VWR international
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