방법 논문

DNA 안정 - 동위 원소 (DNA - SIP) 탐색

DOI:

10.3791/2027

⸱

2010년 8월 2일

 , 
1Department of Biology, University of Waterloo

이 논문에서

요약

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DNA 안정 - 동위 원소 탐색 특정 기판을 활용 능력이 미생물의 활성 커뮤니티를 식별하고 특징을 재배 독립 방법입니다. 무거운 동위 원소의 농축 기판의 동화는 미생물 바이오 매스로 분류 원자의 결합에 이르게한다. 밀도 기울기 ultracentrifugation은 하류 분자 분석을위한 DNA 라벨을 검색합니다.

초록

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DNA 안정 - 동위 원소 (DNA - SIP) 프로빙 세포 바이오 매스로 특정 탄소 기판과 영양소 동화 활성 미생물을 식별을위한 강력한 기법입니다. 따라서,이 재배 독립적인 기술은 지상파 및 수생 환경에서 광범위한 거주 다양한 커뮤니티에 신진 대사 기능을 할당을위한 중요한 방법론을했습니다. 안정 동위 원소 - 라벨 화합물과 환경 샘플의 부화에 따라 추출 핵산은 다양한 밀도의 핵산을 분리하는 밀도 기울기 ultracentrifugation 이후 기울기 분별 (분리)를 받게됩니다. 세슘 염화에서 DNA의 정화는 이후 분자 특성 (예 : 지문, microarrays, 클론 라이브러리, metagenomics)의 DNA를 표시하고 unlabelled 검색합니다. 이 조브 비디오 프로토콜은 밀도 기울기 ultracentrifugation, 그라데이션 분류 및 라벨 DNA의 복구를위한 프로토콜의 시각을 단계별로 설명을 제공합니다. 프로토콜은 샘플 SIP 데이터와 하이라이트 중요한 팁을 포함하고 성공 DNA - SIP 분석을 보장하기 위해 고려되어야한다는주의.

프로토콜

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1. 시약의 준비

DNA - SIP는 실제 절차의 사전에 준비되어야 시약의 사용을 필요로합니다. 각 시약 준비에 대한 지침은이 섹션에 나열되어 있으며 이전 SIP 프로토콜 1 일부터 변경됩니다.

  1. SIP의 그라디언트를 준비 세슘 염화물 (CsCl) 솔루션 - 점차적으로 500 ML의 최종 볼륨에 증류수 및 탈이온수에 CsCl의 603.0 g (ddH 2 O)를 용해하여 7.163 M CsCl 솔루션을 준비합니다. 500 ML을 초과하지 않도록주의! 교반하면서 약간 솔루션을 온난 화하면 CsCl의 모든 디졸브 도움이 될 것입니다. 밀폐 aliquots의 최종 해결책 '나누어지는. 저희 연구실에서는 일반적인 저장 연습 다음 부틸 고무 stoppers과 방해 - 봉인된 125 - ML 혈청 튜브에 100 ML aliquots을 준비하는 것입니다. 밀폐 aliquots은 실내 온도 (20 ° C)에서 무한정 저장할 수 있습니다. 물개가 증발과 CsCl "지각"형성을 방지. 세중의 100 μL aliquots 무게에 의해, 또는 신중하게 CsCl 솔루션에 대한 보정이되어 버린 디지털 굴절계 (예 : 레이처트 AR200)​​을 사용하여 솔루션의 밀도를 결정합니다. 일단 성공적으로 보정, 레이처....

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토론

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안정 동위 원소 탐색 - 실험의 적절한 설계 배경 unlabelled 사회 위의 레이블 DNA를 얻기 위해 매우 중요합니다. 부화 시간, 기판 농도, 배양 조건 (예 : 영양분, 토양 수분 함량), 교차 수유와 복제를 샘플에 관련된 고려 사항은 다른 10,18 논의와 우리는 SIP 부화를 디자인할 때 독자가이 간행물을 참조하는 것이 좋습니다되었습니다. 현재 프로토콜에 관련된, 그것은 SIP 그라디언트에서 데이터의 해석과 관련된 추가적인 고려 사항에 대해 아무런 언급을 가치가있다. ultracentrifugation 과정의 특성으로 인해, 특히 분수에 표시하거나 사라지는 밴드는 프로토콜 자체의 유물되지 않도록하기 위해 순수 문화와 네이티브 기판 incubated 샘플로 컨트롤을 포함하는 또한 중요하다. 예를 들어, 초원 심 분리기 기울기 내의 DNA는 아가로 오스 겔 (그림 2A)에 표시되지 않을 수 있지만, 여전히 그라디언트의 전체 길이 (그림 2B)을 오염시킬 수 있습니다. 하지만 M. capsul.......

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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이 작품은 전략적 프로젝트와 자연 과학 및 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 JDN로 디스커버리 기금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Bromophenol Blue시약Fisher ScientificBP115-25
염화 세슘(Cesium chloride)시약Fisher ScientificBP210-500
에탄올(Ethanol), 시약급시약Sigma-Aldrich652261
에티듐 브로마이드(Ethidium bromide)시약Sigma-AldrichE1510
염산(Hydrochloric acid)시약Fisher Scientific351285212
선형 폴리아크릴아마이드(Linear polyacrylamide)시약ApplichemA6587
폴리에틸렌 글리콜 6000(Polyethylene Glycol 6000)시약VWR internationalCAPX1286L-4
염화 칼륨(Potassium Chloride)시약Fisher ScientificAC42409-0010
염화 나트륨(Sodium Chloride)시약Fisher ScientificS2711
수산화 나트륨 펠릿(Sodium Hydroxide pellets)시약Fisher ScientificS3181
Tris base시약Fisher ScientificBP1521
Dark Reader장비Clare ChemicalDR46B
원심분리기(Microcentrifuge)장비Eppendorf5424 000.410
Nanodrop 2000장비Fisher Scientific361013650
주입 펌프(Infusion pump)장비Braintree Scientific, Inc.N/A모델 번호: BSP
주문 상세 내용은 www.braintreesci.com를 참조하십시오.
튜브 실러(Tube sealer)장비Beckman Coulter Inc.358312
초원심분리기(Ultracentrifuge)장비Beckman Coulter Inc.
초원심분리기 로터(Ultracentrifuge rotor)장비Beckman Coulter Inc.362754
자외선 광원(Ultraviolet light source)장비UVP Inc.95-0017-09모든 UV 광원 사용 가능
자외선 차단 안면 보호구(Ultraviolet light face shield)장비Fisher Scientific114051C
부틸 고무 스토퍼, 회색(Butyl rubber stoppers, gray)재료Sigma-Aldrich27232
원심분리 튜브(Centrifuge tubes)재료Beckman Coulter Inc.342412
피하 주사 바늘, 23 gauge, 길이 2”재료BD Biosciences305145
마이크로 튜브, 1.5 mL재료DiaMedAD151-N500
개방형 센터 씰, 직경 20 mm(Open center seals, 20 mm diameter)재료Sigma-Aldrich27230-U
파스퇴르 피펫, 유리제(Pasteur pipettes, glass)재료Fisher Scientific13-678-6C
피펫 팁(Pipet tips)재료DiaMedBPS340-1000카탈로그 번호는 200 μl 팁 기준입니다. 10 또는 20 μl 팁도 동일한 공급처에서 구매할 수 있습니다.
펌프 튜브, 내경 1.5 mm x 벽 두께 1.5 mm재료Appleton Woods
스크류 캡 튜브, 15 mL재료DiaMedAD15MLP-S
혈청 바이알, 용량 125 mL재료Sigma-AldrichZ114014
주사기, 60 mL재료BD Biosciences309653

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
  2. Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a t....

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