단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.
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이 논문에서
요약
초록
단일 분자 형광 현미경 접근의 유틸리티는 지난 10 년간 생물 학적 반응을 이해하는데 큰 소용이 될 입증되었습니다. 세포 내에서 깊은 높은 시간적 및 공간적 해상도로 분자 상호 작용의 조사로 인해 각각의 분자에서 발생하는 본질적으로 약한 신호에 도전 남아있다. 양 외가 최근 작동합니다. 좁은 - 현장 epifluorescence 현미경은 단일 분자 수준에서 nucleocytoplasmic 운송 시각화를 허용 보여주었다. 신호 의존과 독립화물 분자의 단일 분자 접근법 등 핵 수송 시간과 효율 중요한 운동에 의해 얻은되었습니다. 여기 우리는 0.4 MS 12 NM의 향상 spatiotemporal 해상도와 방법론의 접근 방식에 프로토콜을 설명했다. 향상된 해상도는 우리 반 그대로 세포의 핵 기공 단지 (NPC)를 통해 과도 적극적인 전송 및 수동 확산 이벤트를 캡처 수있었습니다. 이 방법은 세포 내의 다른 바인딩과 인신 매매 사건을 elucidating에 사용될 예정입니다.
프로토콜
1. 단일 분자 실험의 셀룰라 시스템의 준비
- 사전에 적어도 하나의 주, 37 ° C를 해동 5 ML 미디어 25cm 두 문화 플라스크에 넣어 주식에서 헬라 세포 라인의 새로운 문화를 시작, 37에서 세포를 품어 ° C 이내에 5 % CO 2 24 시간 보육 및 세포에 대한 최적의 조건을 제공하기 위해 최소한 3 번 나눠. 그러나 세포는 크게 천천히 자신의 성장 속도 proclivity으로 인해 20 개 이상의 시간을 분할해서는 안됩니다. 헬라 세포는 이전에 다음 ID로 유전자 핵 봉투 기공 막 단백질 POM 121에 융합 GFP를 (녹색 형광 단백질)하도록 설계되었습니다. 그것은 핵 봉투의 정확한 현지화 필요합니다.
- 하루 전에 실험, 단일 분자 실험을위한 세포는 멸균 페트리 접시에 배치 autoclaved 커버 슬립에 전파해야합니다. coverslip는 4.5 g / L의 포도당, 862 MG / L GlutaMAX - I, 15 MG / ML 페놀 레드, 100 U / ML 페니실린, 100μg/mL와 보충 DMEM (Dulbecco의 수정 이글 배지, 그랜드 아일랜드, NY)에서 일시 중지되어야합니다 스트렙토 마이신와 10 %의 신생아 송아지 혈청. 문화의 볼륨 균일하게 표면 전체를 통해 분산 커버 슬립 당 ....
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토론
케어는 실험 도중 NE 및 단일 분자의 적절한 colocalization 확보로 이동해야합니다. 신호가 낮은 가난한 라벨 또는 photobleaching로 인해 특히 때 높은 신호 잡음 비율을 제공하는 것도 중요합니다. 현지화 정밀도는 배경 잡음 (아웃 - 오브 - 초점 형광, CCD 판독 잡음, 어두운 현재 및 기타 요인으로 인한)에 의해 제한됩니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 연구 능력 향상 그랜트 (볼링 그린 주립 대학)에 의해 지원되었다.
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참고문헌
- Ma, J., Yang, W. Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).
- Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. Single Molecule Imaging of the Calci....
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재인쇄 및 허가
