RNA 간섭 (RNAi) 기반 요법의 개발을위한, 소설 전략은 transkingdom RNAi (tkRNAi)를 개발하였습니다. 이 기술은 생산과 대상 세포로 치료 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 제공하는 비 병원성 박테리아를 사용합니다. 여기 tkRNAi가 성공적으로 암 세포의 고전 ABCB1 - 중재 multidrug 저항 (MDR)의 반전을 위해 적용되었다.
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이 논문에서
요약
초록
RNA 간섭 (RNAi)는 mRNA의 표현의 구체적인 억제를위한 높은 효과적인 메커니즘을 나타냅니다. 강력한 실험실 도구로서의 가능성이 외에도, RNAi 경로는 치료 활용에 대한 가능성 것으로 보인다. RNA 간섭 (RNAi) 기반 요법, 인도의 개발을위한 RNAi - 중재 대상 세포에 대리인 것이 가장 큰 장애물 중 하나입니다. 이 장애물을 극복하기 위해 소설 전략 transkingdom RNAi (TK RNAi)입니다. 이 기술은 생산과 RNAi를 유도하는 대상 세포로 치료 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 제공하는 이외의 병원성 세균, 예를 들어 대장균을 사용합니다. 첫 세대 TK RNAi - 중재 벡터, 여행, 관심의 치료 shRNA의 표현 규제에 대한 박테리오 파지 T7 프로 모터가 포함되어 있습니다. 또한, 여행 β1 - 인테 - 긍정적인 포유 동물 세포 listeriolysin O.이 효소를 생산 리스테리아 monocytogenes의 HlyA 유전자를 입력하는 자연 비침 투 박테리아를 허용 invasin을 인코딩 Yersinia의 pseudotuberculosis에서 인보이스 로커스을 가지고하면 치료 shRNA가에서 탈출하실 수 있습니다 항목은 대상 세포의 세포질 내에 vesicles. 여행 구조가 shRNAs의 T7 프로 모터 구동 합성에 필요한 T7 RNA 효소를 인코딩 능력 이외의 병원성 대장균 스트레인로 소개하고 있습니다. 다양한 RNAi 전략에 대해 잘 특징 암 관련 대상 분자가 ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp)입니다. 마약 압출 펌프 및 mediates의 "고전"ABCB1 - 중재 multidrug 저항 (MDR) 특정 교차 저항 패턴이 특징입니다 인간의 암 세포의 표현형으로 ABC - 전송 역할을합니다. 다른 ABCB1 - 표현 MDR 암 세포는 안티 - ABCB1 shRNA 벡터 표현 베어링 E. 취급했다 대장균. 이 절차는 암 세포 내에서 RNAi 경로의 활성화와 ABCB1 인코딩 mRNA의 상당한 아래 규정뿐만 아니라 해당 약품 압출 펌프 결과. 따라서, 약물 축적이 간직한 약물 모성 암 세포의 향상되었으며 MDR의 표현형이 반대했습니다. 이 모델에 의해 데이터가 TK RNAi 인간 암 세포에서 암 관련 요인, 예를 들어 ABCB1의 변조에 적합한 것을 증명 개념을 제공합니다.
프로토콜
shRNAs 1) 세균성 배달
- 세균성 문화와 시작하기 전에, 하나는 LB - 미디엄과 LB - 한천을 준비한다.
- LB - 매체는 효모 추출물 (0.5 % W / V), bacto tryptone (1.0 % W / V) 및 NaCl (0.6 % W / V)을 무게와 아쿠아 bidest에서 이러한 구성 요소를 희석하십시오. 준비 솔루션은 압력솥에 소독을해야하고 사용할 수 있습니다.
- LB - 한천 플레이트에 대한 bacto 한천 (1.5 % W / V)은 살균 이전 LB - 매체에 추가되어야합니다.
- LB - 한천이 완전히 해산 때까지 전자 레인지에 LB - 한천을 가열. 병가 불에받지 않고 쉽게 감동 수있을 때까지 솔루션은 진정하자. 추가 단계에 긍정적인 클론의 선택에 대한 kanamycin을 (100 MG / ML) 추가합니다.
- 10 cm 페트리 - 요리로 LB - 한천 솔루션 20 ML을 pipetting하여 층류 벤치 (무균 조건)에 LB - 한천 플레이트를 준비합니다. 액체가 고체가 될 때까지 플레이트가 진정하자. 접시는 이제 사용할 수 있습니다 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- ShRNA 인코딩 표현 벡터는 관할 E.로 변환 아르 CaCl 2....
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토론
휴대폰 번호는 감염 씨앗과 해당 뫄 사용되는, 비판적으로 세포 관찰하에 라인과 성장을 자신의 속도에 따라 달라집니다. 시딩을위한 최적의 휴대 전화 번호를 찾으려면, 사전 실험 성장의 속도를 결정하는 것이 좋습니다. 이 외에, 다른 MOIs는 세포가 스트레스 죽어없이 박테리아 침공 서있을 수있는 어떤 확장으로 인해 제한을 테스트해야합니다. 관찰에서 유전자의 아래 규정이 다를 수 있습니다 시간의 최적 가리 킵니다. 이것은 최적의 조건을 찾기 위해 특정 기간 동안 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
작품은 부여없이 지원했습니다. "Bundesministerium FÜR Forschung 놀이 Technologie (BMBF)의 01GU0615.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 한천(Agar) | Biochrom AG | 214050 | |
| Amphotericin B | Biochrom AG | A2612 | |
| Dulbecco 인산 완충 식염수-PBS (10 x) | Invitrogen GmbH | 14080048 | |
| E. coli ceq221 | Cequent Pharmaceuticals Inc. | 카탈로그 번호 없음, 직접 주문 | |
| Gentamycin | Biochrom AG | A2710 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen GmbH | 0.85% 식염수 내에 penicillin G (sodium salt) 및 streptomycin sulfate를 사용하여 penicillin (base) 5,000 units 및 streptomycin (base) 5,000 μg/ml 함유. | |
| 염화나트륨(Sodium chloride) | Merck KgaA | 1064060500 | |
| 트립톤(Tryptone) | Difco Laboratories | 211705 | |
| 효모 추출물(Yeast Extract) | Difco Laboratories | 212750 |
참고문헌
- Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells. Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).
- Lage, H.
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