항원 노출에 따라 활성화된 B 세포의 subpopulations는 독특한 효과기 기능 항체 isotypes를 만들어 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 공정을 받고있다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 CSR을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다 체외에서 B 세포 기능을 공부 목적.
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이 논문에서
요약
초록
체액성 면역은 B 세포에 의해 유지 및 항체의 분비를 통해 중재 면역 시스템의 지점이다. B 세포 활성화되면 면역 글로불린 로커스는 바인딩 용량과 분비 항체의 이펙터 기능을 변경하는 유전자 수정 일련의를 겪습. 이 프로세스는 기본 IgM 항체의 isotype은 IgG, 이가, 또는 IGE 중 하나에 대체되는 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 게놈 재조합 이벤트로 강조 표시됩니다. 각 isotype되므로 면역의 유지 관리 CSR은 중요하고 독특한 이펙터 기능을 가지고 있습니다.
면역 글로불린 로커스의 다변화는 효소 활성 유발 cytidine deaminase의 (AID)에 의해 중재됩니다. 자세히이 과정을 설명하는 도식 동영상은 온라인 (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html)입니다. AID의 활동 및 CSR의 경로는 일반적으로 B 세포 기능과 마우스의 체액성 면역의 평가에서 공부하고 있습니다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 murine spleens와 클래스 (다른 항체 isotypes에 대한 표 1 참조) IgG3로 전환 유발하는 박테리아 lipopolysaccharide (LPS)와 후속 자극에서 B 세포 분리의 방법을 보여줍니다. 또한, 형광 세포 염색 얼룩 Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)를 자극 세포의 세포 분열, 스위칭 1, 2 isotype에 중요한 프로세스를 모니터하는 데 사용됩니다.
구호품과 CSR이 발생하는 메커니즘의 규정은 아직 불분명하고 있으므로 체외 클래스 스위치 assays 다양한 마우스 모델에서 이러한 프로세스를 테스트하기위한 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이러한 assays는 이전에 다음 ID로 녹아웃 마우스 3를 사용하여 유전자 결핍의 맥락에서 사용되었습니다. 또한, 관내는 B 세포의 스위칭 RNA의 분해 또는 transgene 표현 4-6에 의해 유전자 발현을 조절하는 바이러스 전달 앞에 수 있습니다. 실험 이러한 종류의 데이터는 구호 활동, CSR 반응의 해상도 및 마우스에서 항체 - 매개 면역에 대한 우리의 이해에 영향을합니다.
프로토콜
단계 I : 자기 강화를 통해 지라 B 세포의 절연
- 실험 생쥐는 면역 체계의 전체 성숙을 보장하기 위해 8~12주 이상되어야합니다.
- 자궁 경부 전위로 마우스를 안락사와 70 % 에탄올에서 만끽해보세요. 수술 복부의 왼쪽 hypochondrium의 피부와 근육을 통해 절개하여 비장을 제거하고 인산의 3 대 조각으로 잘라 (PBS) 살린 버퍼. 모든 도구와 시약은 멸균 수 있도록.
- 부드럽게 매쉬는 PBS로 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 1 ML 주사기 플런저의 고무 끝을 비장 사용합니다. 연삭가 큰 (proliferating 예) 세포의 파열로 이어질 수 있으므로 추진 운동보다는 연삭 모션을 사용해야합니다.
- 5 분 더 이상 350 이상 g에서 세포를 스핀 다운 및 PBS의 펠렛을 resuspend. hemocytometer를 사용하여 resuspended 세포를 계산합니다.
- 뚜껑이있는 멸균 5 ML의 폴리스티렌 튜브 5% 정상 쥐의 혈청 (튜브 당 2 ML 최대 볼륨)과 1x10 8 셀 / PBS에 ML의 정지를 준비합니다.
- 세포의 모든 ML에 대한 부정적 EasySep 선택 마우스 B 세포 농축 칵테일 50 μL를 추가합니다. 혼합물을 피펫, 튜브 캡, 15 분....
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토론
위에서 설명한 프로토콜은 기본 murine B 세포의 클래스 스위칭하는 동안 보조 표현과 기능을 분석하기위한 표준 분석을 제공합니다. 자극 미디어에 수정이 다른 isotypes (표 1 8, 9에 요약)으로 전환 유도하기 위해 만들 수 있지만이 프로토콜은, IgM에서 IgG3로 전환 유발하는 박테리아 LPS를 사용합니다.
우리는 아직 알려지지 않은 이유로, 태아 송아지 혈청 클래스 체외에서 관찰 전환 수준에 영향을 미칠 수 있다고 지적했습니다. 그것은 같은 많은 번호가 실험 일관성을 보장하기 위해 모든 CSR 실험에 사용하는 것이 중요합니다. 또한 체외 스위칭 속도에 최적의 달성 소태아 혈청 소스 패널을 화면으로 도움이 될 수 있습니다. 마우스 변종은 또한 체외 10 본 클래스 스위칭의 정도에 영향을 줄 수 있습니다. 충분히 C57BL / 감지할 수있을 정도의 스위칭 속도를 달성 6 배경 backcross.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 도움이 토론에 대한 마틴의 실험실에 감사하고 있습니다. 이 책자는 건강 연구의 캐나다 연구소 (걸레 - 89783)에서 부여로 지원됩니다. AM은 캐나다 연구 의자 티어 II 수상에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 인산염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline) | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EasySep 마우스 B 세포 농축 키트(EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit) | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| 폴리스티렌 튜브(Polystyrene tubes) | BD Biosciences | 352058 | |
| 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CellTrace CFSE 세포 증식 키트(CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit) | Invitrogen | C34554 | |
| 우송아지 혈청(Bovine Calf Serum) | Hyclone | SH30072.03 | |
| RPMI 1640 배양 배지(RPMI 1640 Culture Medium) | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Escherichia coli 유래 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharides) | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum) | Hyclone | SH30396.03 | |
| 정상 마우스 혈청(Normal Mouse Serum) | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| 정제된 랫드 항-마우스 CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| 랫드 항-마우스 IgG3(Rat Anti-Mouse IgG3) | BD Biosciences | 553401 |
참고문헌
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are....
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재인쇄 및 허가
