이 프로토콜에서 우리는 가용성 단백질 세제 복합으로 표현, solubilization, 그리고 recombinantly 표현 막 단백질, MexB의 정화를 보여줍니다. MexB는 기회 세균성 병원체 녹농균에서 multidrug 저항 막 수송이다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
표현, 세제 Solubilization 및 멤브레인 전송, MexB의 Multidrug 저항 단백질의 정제
이 논문에서
요약
초록
Multidrug 저항 (MDR), 구조적 및 기능적으로 관련이없는 안티 - 암 약물이나 항생제의 다양한 내성이 될 수있는 암 세포 또는 병원체의 능력이, 공중 보건의 현재의 심각한 문제입니다. 이 multidrug 저항은 에너지 의존 약물 유출 펌프에 크게 때문입니다. 펌프는 독성이 임계값 아래에 자신의 세포 농도를 낮추고, 외부 매체에 방지 암 약물이나 항생제를 추방. 우리는 예를 들어, 화상 또는 낭성 섬유증, 또한 단백질 손상 암, 투석과 이식 환자에서 녹농균, 부상 또는 질병의 많은 종류의 환자에서 감염을 일으키는 기회 세균 병원체에 multidrug 저항을 연구하고있다. P.의 주요 MDR의 유출 펌프 녹농균이라는 박테리아는 내부 멤브레인 프로톤 - 약물 antiporter (RND), 외부 멤브레인 채널 (OMF) 및 periplasmic 링커 단백질 (MFP) 1-8 구성되어 삼자 간의 단지입니다. RND 및 OMF 단백질 transmembrane 단백질입니다. Transmembrane 단백질은 모든 단백질의 30 % 이상을 구성하고 현재의 약물 타겟의 65 %입니다. 소수성 transmembrane 도메인은 수성 버퍼에 단백질이 불용성합니다. transmembrane 단백질을 정화하기 전에, 그것은 단백질이 단백질 세제 단지 (PDC) 9-11로 solubilized 수 있도록 가벼운 세제를 포함하는 버퍼 조건을 찾을 필요가 있습니다. 이 예제에서, 우리는 RND 단백질, P.을 사용 , transmembrane 단백질의 재조합 형태로 표현이 세제를 사용 solubilize 다음 단백질 세제 단지를 정화하는 방법을 보여주는 녹농균이라는 박테리아의 MexB의 transmembrane 수송. 이것은 일반적인 방법은 표현, 정화 및 기타 여러 recombinantly 표현 막 단백질의 solubilization 적용할 수 있습니다. 단백질 세제 단지는 나중에 X - 선 결정 구조의 결정이나 crosslinking 연구를 포함한 생화 학적 또는 biophysical 특성화 사용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 1 일 :
녹농균의 MexB는 pFB101에 의해 인코딩됩니다. MexB 유전자가 증폭되었다 P.부터 녹농균이라는 박테리아의 게놈의 DNA와 NdeI과 pET30b + 벡터의 XhoI 제한 사이트에 삽입. 구조는 C - 터미널 hexahistidine 태그를 포함하고 있습니다.
- 플라스미드가 E.을 변환하는 데 사용됩니다 대장균은 C43 (DE3) 12 변형율과 transformants 30 UG / ML kanamycin이 포함된 LB 한천에 도금입니다.
2. 일 2 : 숙박 문화 :
- 저녁에는, 30 UG / ML kanamycin이 포함된 4 X 3 ML의 LB 문화는 신선한 transformant의 식민지에서 주사를하고 있습니다. 또는 문화가 얼어 파마에서 주사 수 있습니다.
이러한 작은 문화가 ° C 야간 37 롤러에 성장하고 있습니다.
3. 3 일 : 6 리터 문화를 성장 :
- 아침에, 30 UG / ML kanamyci....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이온 전달, 세포 - 세포 통신, 소포 수송, 세포 구조의 유지 보수 및 호스트 병원체 상호 작용을 포함한 저항, 많은 중요한 세포 활동을 multidrug뿐만 아니라, 세포막에 포함된 단백질을 포함하고 있습니다. Transmembrane 단백질 알려진 단백질의 30 % 이상 만들어 사용 오늘날 의약품의 대다수에 대한 대상입니다. transmembrane 단백질의 접힘이나 부적 절한 활동은 낭성 섬유증과 당뇨병을 포함하여 중요한 유전 질환,로 이어집니다. transmembrane 단백질의 광대한 중요성에도 불구하고, 수용성 단백질에 비해 자신의 구조와 분자 구조에 대해 훨씬 덜 알려져있다. 소수성 시퀀스의 존재는 그것이 어려운 이러한 단백질의 다량을 표현하고 분리하고 많은 생화학 및 구조 방법들이 내화물하게하실 수 있습니다.
이 프로토콜은 가용성 단백질 세제 복합으로 MDR 막 단백질의 표현, 세제 solubilization과 정화를 보여주었다. 이러한 방법은 많은 rec.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 및 Biomolecular 과학 협회에서 CJJ 부여에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| SDS 샘플 버퍼 | Bio-Rad | 161-0737 | |
| C43(DE3) E. coli 균주 | Lucigen | 60345-1 | |
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| 2XYT 배지 | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| LB 배지 | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| 15ml 튜브 | Corning | 430052 | |
| See-Saw Rocker | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Talon 금속 친화성 레진 | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% polyacrylamide SDS PAGE 겔 | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Tris/glycine/SDS PAGE 러닝 버퍼 | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Kaleidascope prestained 분자량 마커 | Bio-Rad | 161-0324 | |
| Superose 12 30/10 컬럼 | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Amicon 원심분리 농축기 | EMD Millipore | UFC801024 | |
| 시린지 필터 | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Fernbach 플라스크 | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Fernbach 플라스크용 쉐이커 | Fisher Scientific | ||
| Akta 시스템 | GE Healthcare | ||
| JLA-8.1000 로터가 장착된 J6 대용량 원심분리기 | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1 l 원심분리 병 | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| RC-5 원심분리기 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| SS34 고정각 로터 및 튜브 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Sorvall 플로어 모델 초원심분리기 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| T647.5 로터 및 캡 포함 튜브 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
참고문헌
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
