Method Article

표현, 세제 Solubilization 및 멤브레인 전송, MexB의 Multidrug 저항 단백질의 정제

DOI:

10.3791/2134

⸱

December 3rd, 2010

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois Chicago - UIC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서 우리는 가용성 단백질 세제 복합으로 표현, solubilization, 그리고 recombinantly 표현 막 단백질, MexB의 정화를 보여줍니다. MexB는 기회 세균성 병원체 녹농균에서 multidrug 저항 막 수송이다.

Abstract

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Multidrug 저항 (MDR), 구조적 및 기능적으로 관련이없는 안티 - 암 약물이나 항생제의 다양한 내성이 될 수있는 암 세포 또는 병원체의 능력이, 공중 보건의 현재의 심각한 문제입니다. 이 multidrug 저항은 에너지 의존 약물 유출 펌프에 크게 때문입니다. 펌프는 독성이 임계값 아래에 자신의 세포 농도를 낮추고, 외부 매체에 방지 암 약물이나 항생제를 추방. 우리는 예를 들어, 화상 또는 낭성 섬유증, 또한 단백질 손상 암, 투석과 이식 환자에서 녹농균, 부상 또는 질병의 많은 종류의 환자에서 감염을 일으키는 기회 세균 병원체에 multidrug 저항을 연구하고있다. P.의 주요 MDR의 유출 펌프 녹농균이라는 박테리아는 내부 멤브레인 프로톤 - 약물 antiporter (RND), 외부 멤브레인 채널 (OMF) 및 periplasmic 링커 단백질 (MFP) 1-8 구성되어 삼자 간의 단지입니다. RND 및 OMF 단백질 transmembrane 단백질입니다. Transmembrane 단백질은 모든 단백질의 30 % 이상을 구성하고 현재의 약물 타겟의 65 %입니다. 소수성 transmembrane 도메인은 수성 버퍼에 단백질이 불용성합니다. transmembrane 단백질을 정화하기 전에, 그것은 단백질이 단백질 세제 단지 (PDC) 9-11로 solubilized 수 있도록 가벼운 세제를 포함하는 버퍼 조건을 찾을 필요가 있습니다. 이 예제에서, 우리는 RND 단백질, P.을 사용 , transmembrane 단백질의 재조합 형태로 표현이 세제를 사용 solubilize 다음 단백질 세제 단지를 정화하는 방법을 보여주는 녹농균이라는 박테리아의 MexB의 transmembrane 수송. 이것은 일반적인 방법은 표현, 정화 및 기타 여러 recombinantly 표현 막 단백질의 solubilization 적용할 수 있습니다. 단백질 세제 단지는 나중에 X - 선 결정 구조의 결정이나 crosslinking 연구를 포함한 생화 학적 또는 biophysical 특성화 사용할 수 있습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 1 일 :

녹농균의 MexB는 pFB101에 의해 인코딩됩니다. MexB 유전자가 증폭되었다 P.부터 녹농균이라는 박테리아의 게놈의 DNA와 NdeI과 pET30b + 벡터의 XhoI 제한 사이트에 삽입. 구조는 C - 터미널 hexahistidine 태그를 포함하고 있습니다.

  1. 플라스미드가 E.을 변환하는 데 사용됩니다 대장균은 C43 (DE3) 12 변형율과 transformants 30 UG / ML kanamycin이 포함된 LB 한천에 도금입니다.

2. 일 2 : 숙박 문화 :

  1. 저녁에는, 30 UG / ML kanamycin이 포함된 4 X 3 ML의 LB 문화는 신선한 transformant의 식민지에서 주사를하고 있습니다. 또는 문화가 얼어 파마에서 주사 수 있습니다.
    이러한 작은 문화가 ° C 야간 37 롤러에 성장하고 있습니다.

3. 3 일 : 6 리터 문화를 성장 :

  1. 아침에, 30 UG / ML kanamyci....

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Discussion

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이온 전달, 세포 - 세포 통신, 소포 수송, 세포 구조의 유지 보수 및 호스트 병원체 상호 작용을 포함한 저항, 많은 중요한 세포 활동을 multidrug뿐만 아니라, 세포막에 포함된 단백질을 포함하고 있습니다. Transmembrane 단백질 알려진 단백질의 30 % 이상 만들어 사용 오늘날 의약품의 대다수에 대한 대상입니다. transmembrane 단백질의 접힘이나 부적 절한 활동은 낭성 섬유증과 당뇨병을 포함하여 중요한 유전 질환,로 이어집니다. transmembrane 단백질의 광대한 중요성에도 불구하고, 수용성 단백질에 비해 자신의 구조와 분자 구조에 대해 훨씬 덜 알려져있다. 소수성 시퀀스의 존재는 그것이 어려운 이러한 단백질의 다량을 표현하고 분리하고 많은 생화학 및 구조 방법들이 내화물하게하실 수 있습니다.

이 프로토콜은 가용성 단백질 세제 복합으로 MDR 막 단백질의 표현, 세제 solubilization과 정화를 보여주었다. 이러한 방법은 많은 re​​c.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로젝트는 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 및 Biomolecular 과학 협회에서 CJJ 부여에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SDS 샘플 버퍼Bio-Rad161-0737
C43(DE3) 대장균 균주Lucigen60345-1
카나마이신 설페이Sigma-AldrichK4378
2XYT 매체Fisher ScientificBP2466-2
LB 매체Fisher ScientificAC61189-5000
IPTGSigma-AldrichI6758
DNaseIFisher ScientificBP3226-1
리소자임시그마-알드리치L7651
완전한 EDTA 무함유 프로테아제 억제제 정제Roche Group11 873 580 001
NaP 단염기성 시그마-알드리치S6566
NaP 이염기성시그마-알드리치S5136
NaClSigma-AldrichS6191
MgCl2Sigma-AldrichM1028
글리세롤Fisher ScientificBP229-1
n-dodecyl-β-D-maltopyranosideAnatraceD310
15ml 튜브Corning430052
See-Saw RockerFisher ScientificSSL 4
Talon 금속 친화성 수지Clontech Laboratories635503
이미다졸Sigma-AldrichI5513
10% 폴리아크릴아미드 SDS PAGE 겔Bio-Rad161-1454
Tris/glycine/SDS PAGE 러닝 버퍼Bio-Rad161-0732
Kaleidascope prestained molecular weight markersBio-Rad161-0324
Superose 12 30/10 열GE Healthcare12 10/300 GL
Amicon 원심 농축기EMD MilliporeUFC801024
주사기 필터Fisher ScientificSLFG R04 NL
Fernbach 플라스크Fisher Scientific09-552-39
Fernbach 플라스크를 고정하는 셰이커Fisher Scientific
Akta 시스템GE 헬스케어
J6 JLA-8.1000 로터가 있는 대형 원심분리기Beckman Coulter Inc.
1리터 원심분리기 병Beckman Coulter Inc.
RC-5 원심분리기Thermo Fisher Scientific, Inc.
SS34 고정각 로터 및 튜브Thermo Fisher Scientific, Inc.
Sorvall 플로어 모델 초원심분리기Thermo Fisher Scientific, Inc.
T647.5 로터 및 캡이 있는 튜브Thermo Fisher Scientific, Inc.08322
프랑스 압력 셀Thermo Fisher Scientific, Inc.FA-032
트 969329

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
  2. Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H.

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MexB ProteinMembrane TransporterDetergent SolubilizationProtein PurificationGel Filtration ChromatographyIMAC PurificationSDS PAGE AnalysisMembrane IsolationFrench Pressure CellUltracentrifugation

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