방법 논문

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

DOI:

10.3791/2150

⸱

2010년 12월 11일

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY-University at Buffalo

이 논문에서

요약

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우리는 개최 준비하는 절차를 설명 Drosophila embryogenesis 동안 배아 신경 시스템의 시각화를위한 배아.

초록

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Drosophila의 배아가의 연결을 발전의 세포 및 분자 기초를 조사하는 매력적인 모델 시스템입니다. 여기의 연결을 단백질에 항체를 사용하여 Drosophila 배아 신경 시스템의 시각화를위한 절차를 설명합니다. 전체 배아 주변 신경 및 중추 신경 시스템이 잘 개별 세포 수준 (..; Bodmer 외, 1987;. Dambly - 쇼디에르 외, 1986 Bodmer 외, 1989)에서 특징 때문에, 이러한 시스템에 어떤 aberrations 수 쉽게 다른 단백질의 연결을하기 위해 항체를 사용하여 식별됩니다. 개발 배아는 배아는 시각화에 대한 적절한 발달 단계에 있는지 확인하기 위해 특정 시간에 수집하고 있습니다. 수집 후, 배 (胚)의 바깥쪽 레이어, chorion 막과 배아를 둘러싼 vitelline 봉투가 고정되기 전에 제거됩니다. 배아는 다음의 연결 항체와 incubated하고 찬란 레이블 차 항체를 사용하여 시각입니다. 단계에서 배아가 12-17 배아 신경 시스템에 액세스할 시각입니다. 12 단계 CNS의 배아 밴드 단축을 시작하고 단계 15 일까지 접합면의 확실한 패턴이 달성되었습니다. 단계 17으로 CNS 계약 및 PNS는 완전히 (캄포스 - 오르테가 외. 1985) 개발되고 있습니다. 따라서 PNS와 CNS의 패턴의 변화는 쉽게 이러한 발달 단계 동안 볼 수 있습니다.

프로토콜

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1. 시약의 준비

  1. 100mM 파이프, 2mM EGTA, 1 MM MgSO 4를 사용 PEMFA 버퍼를 준비합니다. 7.0 버퍼의 산도를 조정합니다. PEMFA 버퍼는 필터 소독과 4 ° C.에 저장됩니다
  2. 중 1ml를 추가하여 PBT를 준비 트리톤 X - 100 100ml 1X PBS (인산이 살린 버퍼) (산도 7.0). 4 스토어 ° C.
  3. 1X PBS (산도 7.0)에 0.01 % NaAcide와 5% BSA를 (소 혈청 알부민) 준비합니다.
  4. 0.7 % NaCl 및 0.03 % 탈이온수에서 트리톤 X - 100을 사용하여 생리 식염수를 준비합니다.
  5. 한 부분은 37 % 포름 알데히드 4 개 부품 PEMFA 버퍼를 결합하여 정착액을 준비합니다.

2. 태아 수집

  1. 한천 먹이 플레이트와 어댑터를 포함한 플라스틱 병 속에> 100 파리를 배치하여 관심 Drosophila 변형에 케이지를 준비합니다.
  2. 파리가 케이지에 acclimated하고 그들의 계란을 보유하지 않게, 접시마다 8-12시간을 변경, 72 시간 동안 실온에서 어둠 속에 파리의 새장을 둡니다.
  3. 실험은 12 시간 동안 배아를 수집하십시오. 컨테이너에서 페트리 접시를 제거하고 교체합니다. 삭제 페트리 접시를 가지고 생리 식염수와 깨끗한 페인트 브러쉬를 사용하여 요리에서 배아를 씻으십시오.
  4. 훌륭한 체에서 배아를 수집합니다. 초과 누룩을 제거하는 호수와 린스.
  5. 주걱을 사용하면 부드럽게 배아를 선택하고 모자와 작은 유리관에서 그들을 놓으십시오. 생리 식염수의 1ml에 대해 추가합니다.

3. Chorion 및 Vitelline 점막의 제거 및 고정

  1. 배아의 수집에 따라 50 % 헵탄 50 %의 정착액 결합하여 헵탄 - 수정 솔루션을 준비합니다. 솔루션은 상단과 하단에 정착액에 헵탄와 계층 것입니다.
  2. 유리관에 5 분 동안 생리 식염수에서 그들을 잠복기로 배아를 씻으십시오. 파스퇴르 피펫을 사용하여 여분의 호수를 제거합니다.
  3. 탈이온수와 배아를 씻어.
  4. 3 분 50 % 표백제에서 그들을 잠복기로 배아를 Dechorionate.
  5. 탈이온수로 철저하게 배아를 씻어.
  6. 부드러운 흔들림과 헵탄 - 수정 솔루션 30 분 동안 그들을 잠복기로 배아를 수정.
  7. 파스퇴르 피펫을 사용하면 메탄올이 튜브에서 헵탄를 떠나있는 정착액 (하단 레이어)를 대체합니다. vitelline 막을 제거하기 위해 적극적으로 흔들어. devitellinized 배아는 튜브의 바닥에 싱크 것입니다.
  8. 파스퇴르 피펫을 사용하여 새 유리관에서 배아를 수집합니다. 태아에게 메탄올이있는 5 번 린스, 각 시간 5 분 동안 태아를 품어.

4. 항체 스테 이닝, 마운트, 그리고 시각화

  1. 50% PBT 솔루션과 5 분 50 % 메탄올의 혼합물에서 배아를 Rehydrate. 그렇다면 5 분 백퍼센트 PBT 솔루션 rehydrate.
  2. 4 1 시간 0.01 % NaAcide 솔루션 ° C.와 함께 5 % BSA에서 그들을 잠복기로 배아를 차단
  3. 배아 지금 항체 염색법에 대한 준비가되어 있습니다. 0.01 % NaAcide 솔루션 5 % BSA를 사용하여 적절한 농도로 diluting하여 기본 항체를 준비합니다. 우리는 시스테인 문자열 단백질 (CSP), 기공을 갖는 시냅스 단백질과 표면 glycoproteins와 라벨 모든 뉴런에 존재의 연결을 특정 - 탄수화물 잔기를 인식 방지 HRP 또는 말 무 퍼옥시데이즈 항체, 대한 항체를 사용합니다.
  4. 4 밤새 배아 ° C 기본 항체 솔루션 인치를 품어
  5. 다음 날, 시간의 과정을 통해 PBT와 배아 10 번 씻으십시오.
  6. 적절한 농도를 diluting하여 이차 항체 솔루션을 준비합니다. 우리는 1:200의 농도에 알렉사 차 항체를 사용합니다.
  7. 4 두 시간 동안 태아를 품어 ° C 보조 항체 솔루션 인치
  8. 시간의 과정을 통해 태아에게 PBT 10 번 씻으십시오.
  9. Vectashield 장착 매체 하룻밤 배아를 품어.
  10. 유리 슬라이드에있는 배아를 탑재하고 매니큐어로 커버 슬립을 봉쇄. 형광 현미경을 사용하여 배아를 시각화.

5. 대표 결과

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CSP
figure-protocol-2
HRP - FITC
figure-protocol-3
병합
그림 1 : CSP (적색)와 HRP (녹색)에 대한 항체를 사용하여 스테이지 16-17에서 배아 CNS를 보여주는 대표 이미지. 접합면의 별개의 얼룩을 확인합니다.

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CSP
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HRP - FITC
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병합
그림 2 : CSP (적색)와 HRP (녹색)에 대한 항체를 사용하여 스테이지 16-17에서 배아 PNS를 보여주는 대표 이미지. 주변 뉴런의 반복 패턴을합니다.

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토론

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Drosophila의 배아가의 연결을 개발하는 동안 세포와 분자 변화를 조사위한 강력한 시스템입니다. 이 프로토콜에서는 immunohistochemistry에 대한 전체 마운트 배아를 준비하는 방법을 증명하고있다. 우리는 캐롤과 스콧, 1985 년 설명된 프로토콜에서이 프로토콜을 적응있다. 이 프로토콜은 다른 항체의 연결을 테스트하는 적응 될 수 있지만, 항체의 최적화 할 수 있습니다. 또한, 배아 PNS와 CNS의 발달 결함 다른 돌연변이 라인에서 배아를 비교하여 쉽게 시각하실 수 있습니다. 우리는 성공적으로 모터 단백질 돌연변이 들고 태아의 PNS와 CNS를 시각화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 높은 배율에서 우리는 또한 배아 PNS와 CNS 내에서 axonal 트랙을 평가했습니다.

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
37% formaldehydeFisher ScientificBP531-25
CSPDevelopmental Studies Hybridoma Bank
HRP-FITCJackson ImmunoResearch323-095-021
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgGInvitrogenA-11004
Vectashield 마운팅 매질Vector LaboratoriesH-1000

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
  2. Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages. Neuron. 3, 21-32 (1989).
  3. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. New York. (1985).
  4. Carroll, S. B., Scott, M. P. Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis. Cell. 43, 47-57 (1985).
  5. Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Muscle connections between imaginal discs in Drosophila. Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).

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