우리는 개최 준비하는 절차를 설명 Drosophila embryogenesis 동안 배아 신경 시스템의 시각화를위한 배아.
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이 논문에서
요약
초록
Drosophila의 배아가의 연결을 발전의 세포 및 분자 기초를 조사하는 매력적인 모델 시스템입니다. 여기의 연결을 단백질에 항체를 사용하여 Drosophila 배아 신경 시스템의 시각화를위한 절차를 설명합니다. 전체 배아 주변 신경 및 중추 신경 시스템이 잘 개별 세포 수준 (..; Bodmer 외, 1987;. Dambly - 쇼디에르 외, 1986 Bodmer 외, 1989)에서 특징 때문에, 이러한 시스템에 어떤 aberrations 수 쉽게 다른 단백질의 연결을하기 위해 항체를 사용하여 식별됩니다. 개발 배아는 배아는 시각화에 대한 적절한 발달 단계에 있는지 확인하기 위해 특정 시간에 수집하고 있습니다. 수집 후, 배 (胚)의 바깥쪽 레이어, chorion 막과 배아를 둘러싼 vitelline 봉투가 고정되기 전에 제거됩니다. 배아는 다음의 연결 항체와 incubated하고 찬란 레이블 차 항체를 사용하여 시각입니다. 단계에서 배아가 12-17 배아 신경 시스템에 액세스할 시각입니다. 12 단계 CNS의 배아 밴드 단축을 시작하고 단계 15 일까지 접합면의 확실한 패턴이 달성되었습니다. 단계 17으로 CNS 계약 및 PNS는 완전히 (캄포스 - 오르테가 외. 1985) 개발되고 있습니다. 따라서 PNS와 CNS의 패턴의 변화는 쉽게 이러한 발달 단계 동안 볼 수 있습니다.
프로토콜
1. 시약의 준비
- 100mM 파이프, 2mM EGTA, 1 MM MgSO 4를 사용 PEMFA 버퍼를 준비합니다. 7.0 버퍼의 산도를 조정합니다. PEMFA 버퍼는 필터 소독과 4 ° C.에 저장됩니다
- 중 1ml를 추가하여 PBT를 준비 트리톤 X - 100 100ml 1X PBS (인산이 살린 버퍼) (산도 7.0). 4 스토어 ° C.
- 1X PBS (산도 7.0)에 0.01 % NaAcide와 5% BSA를 (소 혈청 알부민) 준비합니다.
- 0.7 % NaCl 및 0.03 % 탈이온수에서 트리톤 X - 100을 사용하여 생리 식염수를 준비합니다.
- 한 부분은 37 % 포름 알데히드 4 개 부품 PEMFA 버퍼를 결합하여 정착액을 준비합니다.
2. 태아 수집
- 한천 먹이 플레이트와 어댑터를 포함한 플라스틱 병 속에> 100 파리를 배치하여 관심 Drosophila 변형에 케이지를 준비합니다.
- 파리가 케이지에 acclimated하고 그들의 계란을 보유하지 않게, 접시마다 8-12시간을 변경, 72 시간 동안 실온에서 어둠 속에 파리의 새장을 둡니다.
- 실....
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토론
Drosophila의 배아가의 연결을 개발하는 동안 세포와 분자 변화를 조사위한 강력한 시스템입니다. 이 프로토콜에서는 immunohistochemistry에 대한 전체 마운트 배아를 준비하는 방법을 증명하고있다. 우리는 캐롤과 스콧, 1985 년 설명된 프로토콜에서이 프로토콜을 적응있다. 이 프로토콜은 다른 항체의 연결을 테스트하는 적응 될 수 있지만, 항체의 최적화 할 수 있습니다. 또한, 배아 PNS와 CNS의 발달 결함 다른 돌연변이 라인에서 배아를 비교하여 쉽게 시각하실 수 있습니다. 우리는 성공적으로 모터 단백질 돌연변이 들고 태아의 PNS와 CNS를 시각화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 높은 배율에서 우리는 또한 배아 PNS와 CNS 내에서 axonal 트랙을 평가했습니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 37% formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-25 | |
| CSP | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| HRP-FITC | Jackson ImmunoResearch | 323-095-021 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Vectashield 마운팅 매질 | Vector Laboratories | H-1000 |
참고문헌
- Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster. Cell. 51, 293-307 (1987).
- Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. Neurogenesis of th....
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재인쇄 및 허가
