방법 논문

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

DOI:

10.3791/2151

⸱

2010년 10월 15일

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY-University at Buffalo

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은의 라이브 절개를 설명 Drosophila 애벌레.

초록

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axonal 수송의 메커니즘을 Elucidating하면 장거리 수송의 결함은 다른 신경 질환에 미치는 영향에 대해 결정에서 매우 중요하다고 표시했습니다. 이 필수 과정에서 결함의 연결 기능 및 개발에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는을 폭로하기 위해 설계되었습니다 해부 프로토콜을 개발했습니다

프로토콜

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1. 시약의 준비

  1. 7.2 및 필터 소독 128 MM NaCl, 1mM EGTA, 4 MM MgCl 2, KCl 2mM, 5mM HEPES, 1000 ML, PH 36 MM의 자당 다음 화합물을 추가하여 해부 버퍼 준비를 준비합니다.

2. 해부를위한 준비

  1. Siligard 큐브 : 겔은 약 인치 와이드, 1 인치 길이 높이 약 1cm로 잘라입니다. 겔 큐브는 절개 중에 유리 슬라이드에 배치됩니다. 큐브는 두 번 이상 사용할 수 있습니다.
  2. 핀 : 해부에 사용되는 핀 짧게 추가해야합니다. minutien 핀의 날카로운 아래 부분 절개에서 최상의 상태로 작동합니다.
  3. 한 날카로운 microdissection 스프링 가위가 필요합니다.
  4. 이 좋은 밀고 포셉 필요합니다.

3. 애벌레 수집

  1. GFP 태그 소포 단백질을 표현 아르 제 3 instar의 애벌레를 방황하는 것은 배양 접시에 저장됩니다.
  2. 애벌레는 모든 음식을 없애 탈이온수에 씻어 수 있습니다.

4. 애벌레의 라이브 해부

  1. 유충은 유리 슬라이드에 절개의 겔 큐브로 전송됩니다. 유충은 해부 버퍼에 포장되어 있습니다.
  2. 유충은 앞쪽에와 후부가 등의 측면을 가진 두 개의 좋은 핀을 이용하여 pined 있습니다.
  3. microdissection 가위를 사용하여, 작은 상처는 사후 끝에 근처에있는 정중선에서 이루어집니다. 이 절개의 상처가 앞쪽이을 통해 이루어집니다. 이 핀을 사용하여 측면 가장자리에 자른 표피를 핀.
  4. 버퍼를 해부 한 방울을 추가합니다. 조심스럽게 포셉과 창자, 내장 지방의 시체를 제거합니다. 이러한 조직의 대부분은 일반적으로 지느러미 절단하는 동안 밖으로 스며 나오게하다.
  5. 신선한 해부 버퍼로 버퍼를 교체합니다. 유충은 건조한 않을 것입니다 그리고 지속적으로 버퍼를 해부에 있어야합니다.
  6. 생체내 마커의 MitoTracker 또는 LysoTracker에서 사용 Incubations는 해부 버퍼의 생체내 마커의를 diluting하여,이 시간에 이루어집니다. 생체내 표지에의 부화 후 해부 유충에게 신선한 해부 버퍼를 사용하여 여러 번 (5 빠른 세척) 씻으십시오.
  7. 교체 후 마지막 세차 syligard 즉시 coverslip에 핀을 밀어. 애벌레는 이제 관찰을위한 준비가되었습니다.

5. 해부 애벌레의 라이브 영상

  1. 현미경 스테이지와 거꾸로 현미경을 사용하여 이미지에 coverslip와 젤 놓습니다.
  2. 우리는 애벌레 segmental 신경 이내에 이미지 태그를 vesicles로 100x 렌즈를 사용합니다. segmental 신경이 몇 군데되기 전에 복부 신경절의 세포 기관에서 GFP 발현 먼저 평가됩니다. 강력한 GFP의 얼룩이 복부 신경절에 세포 기관에서 관찰하면, 신경은 다음 몇 군데와 평가를 위해 사용됩니다.
  3. CFP / YFP 또는 RFP / YFP에 대한 필터와 분할보기 소프트웨어 생체내에서 우리가 할 수있는 동시에 이미지를 두 개의 태그 단백질과 듀얼 뷰 시스템을 사용합니다.

6. 대표 결과

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그림 1 :. 애벌레 segmental 신경 내에 많은 axonal 트랙에 많은 axonal vesicles을 보여주는 대표 이미지 axonal 쌓일 대표, GFP의 모양을 확인합니다.

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그림 2 : 애벌레 segmental 신경 내에 많은 axonal vesicles로 단일 axonal 트랙을 보여주는 대표 이미지.

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토론

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Drosophila 애벌레 segmental 신경 사이 시냅스 소포 수송의 생체내 이미징에서 axonal 교통의 메커니즘을 연구를위한 강력한 도구입니다. 우리는 이전 반복의 확장은 소포 수송 3 역학에 미치는 영향 명료하게하다 확대 polyQ 반복을 표현 애벌레 신경 내에 전송 역학을 평가하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 이 프로토콜을 사용하는 것은 소포 운동의 속도는 kymograph에 비디오 스트림을 변환하여 결정하실 수 있습니다. 유전학 사용하여 GFP의 소포 운송은 GFP의 표현을 드라이브에 특정 GAL4 드라이버를 사용하여 단일 축삭 내에서 또는 여러 axons 이내 시각하실 수 있습니다. 또한 교통의 역학은 또한 특정 유전자에 대한 변이를 들고 유충에서 볼 수 있습니다. 또한 다른 GFP 변종 (CFP 또는 RFP)로 태그가이 vesicles 동시에 시각하실 수 있습니다.

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다.

MK는 UB의 CURCA하여 학생 연구 수상에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
미세 해부 가위 1개Fine Science Tools스프링 가위 – 날 길이 6mm. 팁 직경 0.125 mm
포셉 2개Fisher ScientificFisherbrand 해부용 Micro-Adson 톱니형 팁 포셉
해부용 핀 한 박스Fine Science ToolsMinutien 핀 직경 0.1mm

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  2. Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
  3. Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).

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재인쇄 및 허가

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태그

GFP

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