셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 조혈 progenitors은 세미 솔리드 매체 식민지를 형성하는에서 시험 관내 분석이다. 콜로니 형태, 세포 형태학 및 유동세포계측법의 조합은 다른 조혈 lineages 따라 분아 따위에 의해 번식하고 차별 progenitors의 능력을 평가하는 데 사용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 조혈 줄기 / 전구 세포는 보통 골수, 코드 혈액, 또는 주변 혈액에서 얻은 있으며, 조혈 및 leukemogenesis을 연구하는 데 사용됩니다. 그들은 림프 및 골수양 lineages로 차별화하는 능력이 있습니다. 셀 (CFC) 분석을 형성 식민지는 semisolid 매체 식민지를 형성하는 능력에 의해 증식 및 조혈 progenitors의 차별 패턴을 연구하는 데 사용됩니다. 입력 세포의 고정 숫자에 의해 형성된 콜로니의 숫자와 형태 차별 progenitors의 능력에 대한 사전 정보를 제공하고 세포 분열 따위에 의해 번식. 전지는 더욱 자신의 번호와 유동세포계측법 및 Giemsa 묻은 슬라이드 morphologic 평가를 사용하여 차별 상태를 평가하기 위해 각각의 식민지에서 또는 전체 접시에서 수확 수 있습니다. 이 분석은 골수양하지만 림프하지 차별을 평가하는 데 유용합니다. 이 맥락에서 용어 골수양는 granulocytic, monocytic erythroid 및 megakaryocytic lineages을 포괄하기 위해 넓은 의미에서 사용됩니다.
우리는 주변 혈액에서 파생 기본 인간의 CD34 + 세포의 분화에 oncogenes의 효과를 평가하기 위해이 분석을 사용했습니다. 이러한 목적 세포에 대한이 사건 NUP98 - HOXA9에서, 제어 retroviral 구조 또는 관심의 oncogene을 표현하는 구성 하나와 transduced 있습니다. 우리는 관심과 GFP 표지의 유전자를 생산하는 bicistronic mRNA를 표현 일반적으로 사용되는 retroviral 벡터, MSCV - IRES - GFP를 사용합니다. 세포 retroviral 전달하기 전에 이틀 동안 크린 시토킨의 면전에서 성장하여 미리 활성화됩니다. 또 이틀 뒤에는, GFP + 세포는 형광 활성화된 셀 정렬 (외과)에 의해 격리되며 크린 시토킨로 보충하고 식민지는 일반적으로 표면을 14 일에 나타날 때까지 incubated 메틸 셀룰로오스 함유 semisolid 매체와 혼합. 식민지의 개수와 형태가 설명되어 있습니다. 세포는 다음 접시에서 제거 씻어, 계산 및 유동세포계측법 및 morphologic 심사를 받게됩니다. 조혈 동안 표현 세포 표면 마커 특정 항체와 유동세포계측법는 가계와 성숙 단계에 대한 정보를 제공합니다. 라이트 - Giemsa의 얼룩 후 현미경으로 각각의 세포의 형태학의 연구는 혈통과 성숙에 관한 자세한 정보를 제공합니다. 세포의 비교 oncogene 조혈 차별에 oncogene의 효과를 밝혀와 transduced들에게 빈 벡터 제어와 transduced.
프로토콜
1. 시약의 준비
- FMS 관련 티로신 키나제 3 멸균 1000x 재고 솔루션 준비 (를 편명 - 3) 리간드, 대식 세포 / 과립구 콜로니 - 자극 인터루킨 (IL) -3 인자 (GM - CSF), 줄기 세포 인자 (SCF), thrombopoietin (TPO), 및 IL - 6 제조 업체의 지시에 따라. 무균 Retronectin 주식 솔루션 (1mg/ml)도 제조 업체의 지시에 따라 준비. 작은 aliquots하여 해당 주식 솔루션을 나누어 반복 동결 - 해동을 피하기 위해 -20 ° C에서 보관.
- IMDM에 2% FBS를 준비합니다.
- 최종 20% FBS의 농도, 2 MM의 글루타민, 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PS) 완벽한 IMDM 매체를 준비합니다. 바로 사용하기 전에 다음과 같은 크린 시토킨 추가 : 100 NG / ML 편명 - 3 리간드, 20 NG / ML GM - CSF, 100 NG / ML SCF, 100 NG / ML TPO, 50 NG / ML IL - 3, 100 NG / ML IL - 6.
- HBSS의 1 % BSA (페놀 레드없이 칼슘 및 MG - 무료) 및 D - PBS (CA & MG 무료)에서 2 % BSA를 준비합니다. 4 0.22 μm의 주사기 필터 및 매....
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토론
CFC의 분석은 조혈 progenitors의 확산과 차별의 패턴을 결정하고 oncogenes의 효과를 (4, 5) 연구에 광범위하게 사용되고 있습니다. 그것은 식민지가 단일 조상의 자손을 나타내는 개별적으로 추가 분석을 위해 제거할 수 있습니다 그러한 clonal 분석,되는 액체 문화 이상의 장점이 있습니다. 이러한 전지는 사용 감지 장기적인 문화 시작 셀 (LTC - IC) 분석 (6, 7). CFC 분석의 한계는 더 어려서 progenitors 또는 조혈 줄기 세포의 검출을 위해 적합하지 않습니다이다 실험은 AML - 관련 oncogene NUP98 - HOXA9은 골수양 및 erythroid 성숙을 억제하고 erythroid 증식 (1, 3) 원인이되는 보여줍니다 여기에서 설명한.
메틸 셀룰로오스 기반의 문화가 비교적 장기이고 CFC 매체 항생제를 포함하지 않기 때문에, 그것은 특히 중과 정렬 후, 세포 문화의 오염을 방지하기 위해 파라마운트 중요하다. 작은 박테리아 또.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 유동세포계측법 장비 및 정렬 서비스를 제공하는 고속 셀 분류기 코어의 사용, 의학 세인트 루이스, MO에있는 반스 - 쥬이시 병원 워싱턴 대학 학교에서 앨빈 J. Siteman 암 센터를 주셔서 감사합니다. 이 작품은 보건 기금의 국립 연구소 R01 HL082549 및 K02 HL084179 (NRY)에 의해 지원되었다. Siteman 암 센터는 NCI 암 센터 지원 그랜트 P30 CA91842에 의해 부분적으로 지원됩니다.....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| IMDM | Life Technologies | 12440 | |
| FBS | Stem Cell Technologies | 06150 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) | Life Technologies | 15140 | |
| FLT-3 리간드 | PeproTech Inc | 300-19 | |
| GM-CSF | PeproTech Inc | 300-03 | |
| SCF | PeproTech Inc | 300-07 | |
| TPO | PeproTech Inc | 300-18 | |
| IL3 | PeproTech Inc | 200-03 | |
| IL6 | PeproTech Inc | 200-06 | |
| 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A | |
| HBSS | Life Technologies | 14175 | |
| PBS | Life Technologies | 14200 | |
| Trypan Blue 용액 (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Methocult GF+ H4435 | Stem Cell Technologies | 04445 | |
| 인간 메틸셀룰로오스 강화 배지(Human Methylcellulose Enriched Media) | R&D Systems | HSC005 | |
| Wright/Giemsa 염색액 | Harleco | 64571 | |
| 인산 완충 용액, pH 6.4 - Giordano 포뮬러 | Ricca Chemical Company | 1450 | |
| 메탄올 | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 8310 | |
| 정상 생쥐 혈청(Normal Mouse Serum) | Rockland Immunochemicals | D208 | |
| Phyc–rythrin 접합 Anti-Human CD11b | BD Biosciences | 555388 | |
| Allophycocyanin 접합 Anti-Human CD33 | BD Biosciences | 551378 | |
| Phyc–rythrin-Cy7 접합 Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 557748 | |
| Phyc–rythrin 접합 Anti-Human CD71 | BD Biosciences | 555537 | |
| Allophycocyanin 접합 Anti-Human CD235a | BD Biosciences | 551336 | |
| Phyc–rythrin-Cy7 접합 Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 557748 | |
| 24-웰 비처리 조직 배양 플레이트 | BD Biosciences | 35-1147 | |
| 30 mm 비처리 디쉬 | Stem Cell Technologies | 27150 | |
| 100 mm 조직 배양 디쉬 | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 격자 무늬 스코어링 디쉬 | Stem Cell Technologies | 27500 | |
| 15 ml 원심분리 튜브 | BD Biosciences | 35-2097 | |
| 50 ml 원심분리 튜브 | BD Biosciences | 35-2070 | |
| 3 ml 주사기 | Stem Cell Technologies | 28240 | |
| 16 게이지 둔단, 1½ 인치 바늘 | Stem Cell Technologies | 28110 | |
| 50 μm CellTrics 세포 필터 | Partec | 04-004-2327 | |
| 혈구계수기(Hemocytometer) | Fisher Scientific | 0267110 | |
| TPX 샘플 챔버 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A78710018 | |
| Fisherbrand Superfrost/Plus 현미경 슬라이드, 사전 세척됨 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Shandon 필터 카드 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5991022 | |
| Shandon 사이토스핀 슬라이드 홀더 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 59920063 | |
| Shandon Complete Staining Assembly 100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| 1 μm 여과지 | VWR international | 28307-134 | |
| 도립 현미경 | Nikon Instruments | Diaphot | |
| 현미경 카메라 | Nikon Instruments | DS-F11 | |
| 현미경 | Olympus Corporation | BX51 | |
| 현미경 카메라 | Olympus Corporation | DP71 | |
| 스캐너 | Microtek | Scanmaker 4 | |
| 볼텍스 믹서 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| 조직 배양 인큐베이터 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 사이토스핀(Cytospin) | Shandon, Inc. | Cytospin 2 | |
| 벤치탑 원심분리기 | Eppendorf | 5810-R | |
| 초순수 제조 시스템 | Barnstead | Nanopure-Diamond |
참고문헌
- Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells. Cancer Res. , 66-6628 (2006).
- Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R.
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재인쇄 및 허가
