시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 이 모델은 전 세계적으로 망막을 대상에 직접 망막 신경절 세포의 부상의 연결 인구를 대상으로 실험 조작의 번호를 수행하는 데 이상적입니다.
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방법 논문
포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법
* These authors contributed equally
이 논문에서
정오 공지
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요약
초록
망막 신경절 세포 (RGCs)는 CNS의 뉴런되는 시신경을 통해 뇌로 망막의 출력 영상 정보. 시신경은 안구의 궤도 내에서 액세스하고 완전히 전체 인구의 RGC axons를 절단 (axotomized) 그었 수 있습니다. 시신경의 절개면은 성인 CNS 1-4에서 apoptotic 세포의 연결을 죽음의 재현성 모델입니다. 눈 유리체 챔버가 intraocular 주사를 통해 실험 조작을 허용, 망막에 약물 전달 캡슐 역할을하기 때문에이 모델은 특히 매력적입니다. 유리 체액을 통해 화학 물질의 확산들은 전체 인구 RGC에 따라 행동을 보장합니다. 바이러스성 벡터, plasmids 또는 짧은 방해 RNAS는 (siRNAs)도 5-12를 망막 세포를 감염 또는 transfect하기 위해 유리 챔버로 전달하실 수 있습니다. Adeno - 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 높은 tropism은 주사 사이트 6, 7, 13-15 가까운 세포의 90 %를 접근 감염 속도와 대상 RGCs에 유용합니다. 또한, RGCs은 선택적으로 그들의 목표 우수한 colliculus 10으로 시신경 16-19 또는 주입 벡터의 컷 끝까지 siRNAs, plasmids, 또는 바이러스성 벡터를 적용하여 transfected 수 있습니다. 이것은 연구자들이 다른 방관자의 뉴런이나 주변 glia에 혼란함을 주죠 효과없이 부상의 연결 인구 apoptotic 메커니즘을 공부하실 수 있습니다. RGC apoptosis는 세포 죽음은 세포가 빠르게 타락한 이후 3~4일의 postaxotomy을 지연 의하여 시간 코스 특성이 있습니다. 이것은 apoptosis에 관련된 경로에 대한 이동 실험 조작에 창을 제공합니다. 직접 가로 시신경 스텀프에서 RGCs를 대상으로 노는 즉시 신경을 절단 후, axotomy의 시간에 수행됩니다. 대조적으로, 물질 intraocular 경로를 통해 전달하는 경우, 그들은 axotomized RGCs에서 apoptosis의 개시를 이전, 이전에 수술이나 수술 후 첫 3 일 이내에 주입 수 있습니다. 현재 기사에서 우리는 시신경의 절개 후 실험 조작을위한 여러 가지 방법을 보여줍니다.
프로토콜
1. 외과 기술
- 실험 무균 기술을 사용하여 특정 기관의 동물 사용 프로토콜에 따라 수행하여야한다. 살아있는 조직과 접촉으로 오는 악기와 자료 (솔루션, 시험 물질, 추적기, 바늘 등) 동물 복지 및 연구에 대한 잠재적인 부정적 영향에 감염하고 불리한 영향을 방지하기 위해 멸균해야합니다.
2. 마취
- 쥐 한 동물 isoflurane 기화기 시스템을 사용 anaesthetized 것입니다. 0.8 L / isoflurane 가스를 기화하는 분의 비율로 의료 학년 산소를 사용하십시오. 첨부된 마취 상자에 동물을 배치하고 호흡이 둔화하고 있으며 동물이 진정 될때까지 4퍼센트의 isoflurane 농도에 전화.
- 다음, stereotaxic 프레임 가스 마스크 첨부 파일에 가스 흐름을 스위치와 stereotaxic 장치에 동물을 놓으십시오. 2 % isoflurane 농도를 켜고 마취를 모니터링합니다. 큰 동물 (> 300g)는 isoflurane의 높은 농도를 필요로 할 수 있습니다. 마취는 수술 중에 모니터링하고 isoflurane 복용량이 적절하게 조정해야합니다. 깊이와 호흡 속도는 지속적으로 평가해야하고, 깊은 고통의 부재에 대한 발가락 핀치 평가 (매 5 분)을 수행하여야한다....
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토론
시신경의 절개면은 성인 CNS의 신경 세포의 apoptosis의 높은 재현성 모델입니다. 이 원고에서 보여준 실험 조작은 부상 후 RGC apoptosis의 메커니즘 연구를 허용합니다.
Intraocular 주사는 망막의 전세계를 타겟하는 데 유용합니다. 그것이 유리 피펫의 끝에있는 렌즈를 다치게하지 않는 것이 중요합니다 같은이 절차는 연습이 필요합니다. 렌즈 손상은 세포 생존과 재생 20, 21을 변경, 성장 요인의 출시를 일으키는 것으로 표시되었습니다. 신중하게 삽입 및 팁의 방향에 유리 피펫의 병렬를 철회하는 것도 중요하다. 유리 피펫의 끝에 모든 측면 힘이 렌즈 또는 망막 손상을 유리체 챔버를 입력 유리 조각을 일으킬 수 있습니다. 너무 괜찮 팁있는 피펫을 사용하면 점성 솔루션의 배달을 허용하지 않을 수 있습니다. 공막엔 실수로 렌즈를 펑쳐링의 기회를 증가 구멍을 때 또한 매우 훌륭한 조언 촉각 피드백을 제공하지 않습니다. 현미경으로 관찰하면 렌즈는.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 정위 고정기 | Stoelting Co. | ||
| 쥐용 가스 마스크 | Stoelting Co. | ||
| 마취 시스템 | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| 수술용 현미경 | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Alcaine 점안액 | Alcon | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | ||
| 미세 팁 Dumont 핀셋 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| 10 μl Hamilton 시린지 (1701RN; 26s/2”/2) | Hamilton Co | 80030 | |
| 1/16 inch 압축 피팅 | Hamilton Co | 55751-01 | |
| 1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK 튜빙 | Supelco, Sigma-Aldrich | Z226661 | |
| Dual RN 유리 커플러 | Hamilton Co | 55752-01 | |
| 미네랄 오일 프라이밍 키트: 시린지, 바늘, 고무 격막 포함 | Hamilton Co | PRMKIT |
참고문헌
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular deter....
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS
Posted by JoVE Editors on 5/31/2011. Citeable Link.
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