여기 우리는 즉시 정화하여 intraperitoneal 접종 다음과 찬란 다음 주사 사이트에서 자신의 이해와 움직임을 모니터링하고 이러한 이벤트를 중재 전지 특성화 감염 두뇌 자료에서 집계 프리온 봉 라벨 면역 세포 프리온 이해와 인신 매매를 감시를위한 소설 분석을 설명합니다.
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방법 논문
Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
비정상적인 형태의 존재 프로 테아제, 모성 pathologic 및 전염성있는 호스트 인코딩된 프리온 단백질 (PrPC)는 같은 양의 cervids과 scrapie의 만성 낭비 질병 (CWD)와 같은 프리온 질병을 특징. 프리온 가설이 비정상 conformer가 대부분 또는 모든 감염성 프리온의를 종속 주장한다. 주변 프리온 pathogenesis 초기 행사에 면역 체계의 역할은 설득 CWD과 scrapie 1-3에 대한 증명되었습니다. 생쥐에 유전자 변형과 pharmacologic 연구는 감염 4-6 후 조기 prions을 유지하고 복제의 보완 시스템의 중요한 역할을 공개했다. 또한 70-10 돌기 세포 프리온 보존을 살펴 봤으니, 체외에서와 생체내 연구에서 매매에서 역할이 남아 있지만, 11-16 불분명. Macrophages는 마찬가지로 초기 프리온 pathogenesis에 연루되어 있지만,이 연구는 감염 후 3,11,17 주 발생하는 이벤트에 초점을 맞추고있다. 이러한 이전 연구는 또한 내생 PrP C와 전염성 prions 간의 차별의 문제에서 고통. 여기 우리가 모집 면역 세포에 의해 접종 사이트에서 프리온 이해와 인신 매매를 평가하기위한 semiquantitative, 편견 방식을 설명합니다. 집계 프리온 막대가 아닌 집계 단백질과 자당의 쿠션을 통해 ultracentrifugation의 세제 solubilization에 감염된 뇌 homogenate에서 정화했다. Polyacrylamide 젤 전기 영동, 쿠매시 푸른 얼룩과 pelleted 분수에 매우 풍부한 프리온 봉의 서쪽 모래 바닥 확인 회복. 프리온 막대는 마우스로 fluorochrome - 라벨이 다음 주입 intraperitoneally했다. 2 시간 후에 복막 세척 유체, 비장 및 mediastinal 및 mesenteric 림프절의 면역 세포는 프리온 막대기 유지 및 monocytes, neutrophils, 돌기 세포, macrophages 및 B 및 T 세포에 대한 마커를 사용하여 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법으로 식별 셀 집합에 대한 assayed했다. 이 분석은 감염 후 시간 이내에 면역 획득 세포와 생체내의 인신 매매 prions의 처음으로 직접 모니터링을 허용합니다. 이 분석은 또한 분명 어렵고 다른 분석 시스템의 데이터 해석에 문제가 발생할 수있는 일반적으로 호스트 세포에 표현 PrPC에서 전염성, 집계 prions를 차별화합니다. 이 프로토콜은 다른 접종 경로 (경구, 정맥, intranervous 및 피하 예)와뿐만 아니라 항원 (복합 비즈, 세균 바이러스 및 기생 병원균과 단백질, 계란)에 적용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 프리온 봉 정화 및 라벨링
이 프로토콜은 한 이전에 출판 18 적응됩니다
- 상업 믹서의 최대 속도로 1 분 후, 얼음에 2 분 얼음 추위 homogenizing 버퍼의 900 ML에서 프리온에 감염된 뇌 조직 100g (HB, 1X PBS 320 MM의 자당, 150 MM NaCl 및 4mm짜리 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 포함하는)를 균질. 세 번 반복합니다.
- 10 3,000 XG에서 분 및 4 ° C.에 대한 homogenate 원심 분리기 제거하고 얼음에 뜨는 저장합니다. 1L HB의 펠렛을 다시 정지 및 단계 1.1과 1.2를 반복합니다.
- 100,000 XG, 0 ° C. 60 분 풀 supernatants 및 원심 분리기 뜨는 폐기하십시오.
- 다시 중지 1X 트리스의 100 ML의 펠렛은 (10 MM 트리스 - HCL, 0.1 MM NaCl 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))이 2퍼센트 트리톤 X - 100 (TBST)이있는 염분 버퍼. 견적 단백질 브래드 또는 이와 유사한 분석하여 농도 5 TBST에 MG / ML을 조절할 수 있습니다. 30 분 얼음 칠.
- 100,000 XG, 0 °....
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토론
여기 우리는 크게 말초 프리온 감염 초기에 이벤트를 모니터링 용이 생체내에 태그 및 추적 prions에 대한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 크게 unambiguously 내생 PrP C에서 차별화에 사전 라벨 매우 풍부한 프리온 inoculum에 의해 체외 9 및 생체내 3,12의 모니터링 프리온 이해에서 과거 시도를 향상시킵니다. 전염성 prions와 PrP C가 동일한 기본 아미노산 서열을 공유하기 때문에 발생 프리온 특정 항체가 문제가되었습니다. 우리는 PK - 소화와 메탄올 우리가 Dylight 649 - labelelled 방지 PrP 항체를 (우리되지 않은 데이터)를 사용하여 추적되는 원유 뇌 homogenate를 시켰던로 주입 PrP의 NULL 마우스를 사용하여 유사한 실험을 수행했습니다. 여기 같이이 실험은 거의 동일한 결과를 생산하지만, PrP NULL 마우스는 프리온 질환
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 마우스 처리와 관련하여 도움이 ultracentrifugation와 패티 키서와 관련하여 도움이 스티브 McBryant와 제프 핸슨 감사드립니다. 국립 보건원의 신경 질환 및 뇌졸중의 국립 연구소, 부여 5R01NS056379 - 02이 작품을 후원.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CWD 감염 엘크 뇌 | 콜로라도의 개인 엘크 농장 | 인간이 아닌 모든 프리온 감염 뇌 사용 가능 | |
| 블렌더 | Oster Professional Products | 6694-015 | 모든 상업용 블렌더 사용 가능 |
| 원심분리기 | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | 3000 x g에 도달할 수 있고 ≥ 500 ml 용량을 수용할 수 있는 모든 원심분리기/로터 사용 가능 |
| 초원심분리기 | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | 100,000 x g에 도달할 수 있고 ≥ 500 ml 용량을 수용할 수 있는 모든 초원심분리기/로터 사용 가능 |
| Bradford 시약 | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| 초음파 파쇄기 | Misonix | MP4000X | 최대 출력의 ~70%로 설정된 모든 혼(horn) 또는 프로브(probe) 초음파 파쇄기 사용 가능 |
| DyLight 항체 표지 키트 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| 마이크로원심분리기 | Eppendorf | 55430R | 13,000x g를 달성할 수 있는 모든 냉장 마이크로원심분리기 사용 가능 |
| 원심 여과 컬럼 | EMD Millipore | Microcon YM-100 | 100 Kd 분자량 컷오프를 가진 모든 필터 또는 투석막 사용 가능 |
| 8-40주령 FVB 마우스 | Charles River Laboratories | 207 | 모든 근친 교배 마우스 계통 사용 가능 |
| 1 μm 적색 형광 비드 | Phosphorex | 2307 | ≤ 10 μm 크기의 모든 형광 비드 사용 가능 |
| RPMI 1640 배지 | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm 세포 스트레이너 | Falcon BD | 352340 | |
| 형광 항체 | BD Biosciences | Various | 실험 목적에 적합한 모든 형광 항체 사용 가능 |
| 유세포 분석기 | Dako | CyanADP | 다색 형광 검출이 가능한 모든 유세포 분석기 사용 가능 |
참고문헌
- Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
- Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
- Sigurdson, C. J.
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재인쇄 및 허가
