마우스 모델에서 Cisterna Magna에 캐뉼라 이식

초록

출처: Xavier, ALR, et al. 설치류의 수조 마그나에 캐뉼라 이식. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 마취된 마우스의 수조에 캐뉼라를 이식하는 절차를 보여줍니다. 이 기술은 바늘에 장착된 캐뉼라를 경막을 통해 거꾸로 된 삼각형 수조 대나로 안내하고 뇌척수액으로 표적으로 전달하기 위해 고정하는 것입니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술 절차
   참고: 만성 수조 마그나(CM) 캐뉼라 삽입을 통해 동물은 수술 절차에서 회복할 수 있습니다. CM 주사는 캐뉼라 이식 다음 날에 이루어지며 중요한 것은 마취 또는 깨어 있는 동물에서 수행할 수 있다는 것입니다. 회복 수술이므로 멸균 상태에서 시술을 해야 합니다.
   1. 마우스의 무게를 측정하고(C57BL/6JRj, 남녀 모두, 8주) 복강내(i.p.) 주사를 통해 케타민과 자일라진(각각 100mg/kg, 10mg/kg)의 혼합물로 마취합니다. 필요한 경우 수술 중에 케타민의 절반 용량(50mg/kg)을 마우스에 재투여합니다. 또는 만성 캐뉼라 삽입의 경우, 약 1 L/min 산소(O₂)에서 2.5 - 3% 이소플루란의 이소플루란 유도 챔버에 마우스를 배치하여 마우스를 마취합니다. 이 경우 노즈콘을 사용하여 수술 내내 1.5 - 2%의 이소플루란 마취를 유지합니다.
   2. 발가락 꼬집기 반사가 멈추고 호흡이 느리고 안정해지면 동물을 가열 패드 위의 정위 고정 프레임에 놓습니다.
   3. 안과용 연고를 바르십시오. 필요할 때마다 수술 중에 반복하십시오.
   4. 쥐의 머리와 목을 면도하고 털을 제거한 후 노출된 피부는 먼저 알코올 면봉으로 살균한 다음 클로르헥시딘(0.5%) 또는 요오드 용액(2%)으로 두 번 살균합니다. 살균을 두 번 더 반복합니다.
      참고: 면도 후 부스러기와 머리카락을 제거하기 위해 수술용 드레이프를 교체하십시오. 그런 다음 무균 영역을 보호하기 위해 동물을 덮습니다.
   5. 만성 캐뉼라 삽입의 경우 절개 부위에 0.5 - 1ml 리도카인/부피바카인(각각 1mg/ml 및 0.25mg/ml)을 피하(s.c.)로 투여합니다. 수술 후 진통을 위해 부프레노르핀(0.05 mg/kg; s.c.)을 투여합니다.
   6. 정위 프레임에 마우스를 고정합니다. 귀 내 또는 광대뼈 아치에 의해 고정을 한 후 머리를 약간 기울여 몸에 대해 120° 각도를 형성합니다(그림 1E).
   7. 목 근육 바로 위에 튀어나온 두개골 부분인 후두엽 능선을 찾으십시오. 핀셋을 사용하여 위에 있는 피부를 들어 올리고 정중선을 따라 약 1cm의 아몬드 모양의 피부 조각을 자릅니다. 면봉이나 눈창을 사용하여 출혈을 조절하십시오.
   8. 후두능을 기준점으로 사용하여 표면 결합 조직을 분리하여 아래의 목 근육을 노출시킵니다.
   전
   9. 후축의 절개 부위 중앙을 따라 겸자를 조심스럽게 움직여 정중선의 근육을 분리합니다. 양손에 한 쌍의 구부러진 집게를 들고 두개골 바닥 근처의 중앙에 있는 끝을 결합하고 근육을 옆으로 당깁니다.
      참고: 이렇게 하면 반투명 경막막 뒤의 위쪽 소뇌와 아래 수질로 윤곽이 그려진 작은 역삼각형으로 나타나는 CM이 노출되어야 합니다(그림 1B 및 1C).
   10. 수술용 안창이나 면봉을 사용하여 CM을 덮고 있는 경막막을 닦습니다.
2. CM
   에 캐뉼라 삽입;>인
   1. 공 뇌척수액(aCSF)으로 채워진 주사기에서 캐뉼라를 제거하고 30G 바늘을 튜브 뒤쪽 끝에 부착한 상태로 유지합니다.
   2. 주사기 펌프에 연결된 증류수로 채워진 100μL 주사기에 30G 바늘을 부착합니다.
   3. 주사기 펌프를 사용하여 공기를 빼내어 캐뉼라에 약 1cm의 기포를 삽입합니다.
   4. 주사기 펌프를 사용하여 원하는 뇌척수액(CSF) 추적자 12μL를 캐뉼라로 추출합니다.
   5. 주로 사용하는 손에 잡은 한 쌍의 구부러진 핀셋으로 튜브로 덮인 바늘 근처에서 CSF 추적자로 채워진 캐뉼라를 잡습니다. 주로 사용하지 않는 손의 가운데 손가락을 반대쪽 이어바에 올려 놓고 나중에 캐뉼라의 휴식으로 사용할 수 있도록 안정적으로 잡습니다.
   6. 캐뉼라를 마우스 헤드에 대해 45° 각도로 삽입하여 경막을 통해 보이는 삼각형 측면으로 식별되는 CM의 중앙으로 통과합니다. 소뇌나 수질의 침투를 피하십시오. 바늘이 경막 아래에 완전히 있는 지점과 같이 1 - 2mm 깊이까지만 삽입되었는지 확인하십시오. 캐뉼라를 잡고 있는 핀셋을 풀고 캐뉼라를 주로 사용하지 않는 손에 놓습니다.
      참고: 치과용 바늘의 경사진 끝은 CM을 덮고 있는 경막막을 뚫기 위해 약간의 힘을 가해야 합니다.
   7. 필요한 경우 수술용 안창이나 면봉을 사용하여 침투 시 CSF 누출을 말리십시오.
   8. 캐뉼라를 둘러싼 경막막에 시아노아크릴레이트 접착제 2-3방울을 바릅니다. 접착제 촉진제 한 방울을 추가하여 접착제를 즉시 경화시킵니다. 치과용 시멘트(약 0.5mg)와 시아노아크릴레이트 접착제(3 - 5방울)의 혼합물로 두개골과 바늘을 덮습니다. 그 직후 접착제 촉진제 한 방울을 바르고 경화시킵니다.

결과

그림 1: 수조에 추적자 주입.) 뇌 및 두개골 구조와 관련하여 수조 마그나(CM)의 위치를 보여주는 마우스 머리와 뇌의 개략적 개요. (B) 주변 목 근육을 뭉툭하게 해부하고 옆으로 밀어낸 후 노출된 CM의 현미경 사진. (C) B(검은색 직사각형)로 표시된 영역의 더 높은 배율로 CM(점선)의 역삼각형 구조와 주변 구조, 즉 후두 능선, 소뇌 및...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SOPIRA carpule 30G 0.3 x 12 mm	Kulzer	AA001
Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate)	Meda AS		http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
알코올 면봉 70% 이소프로필 알코올 30 x 60mm	Vitrex Medical A/S	520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha Ophtha		145250
나무 어플리케이터, 이중 면봉(Ø 대략, 4 - 5 mm, 길이 대략 12 mm)	하인츠 헤렌츠 1032018
아이 스피어 메	디콤	A18005
킴 테크 사이언스 정밀 물티슈 티슈 와이퍼	킴벌리 클라크 프로페셔널	5511
록타이트 슈퍼 글루 정밀 5 g	록타이트		http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html
Insta-Set CA 가속기	Bob Smith Industries	BSI-152
치과용 시멘트 분말	A-M Systems	525000
인산염 완충 식염수(PBS; 0.01 M; pH 7.4)	Sigma Aldrich	P3813
오브알부민, Alexa Fluor 647 접합체	Thermo Fisher Scientific	O34784
DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 용액(1mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	62248
덱스트란, 플루오레세인, 3000MW, 음이온성	Thermo Fisher Scientific	D3305
케타미놀 Vet 100mg/mL(케타민)	Intervet International BV	511519
Rompin Vet 20mg/mL(자일라진)	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
자일로카인 20mg/mL (리도카인)	아스트라제네카	158543
마르케인 2.5 mg/mL(부피바카인)	아스트라제네카	123918
부팍 수의사 0.3 mg/mL(부프레노르핀)	Richter Pharma AG	185159