샘플 수집과 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 뇌 오가노이드에 표지된 세포 주입
참고: 이 논문을 위해 대뇌 오가노이드는 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 생산되었습니다. 이것은 관심 있는 대뇌 오가노이드로 대체될 수 있습니다. 프로토콜의 이 부분에 사용되는 물질은 4°C 이상의 온도에서 가용화된 기저막 매트릭스의 겔화를 방지하기 위해 사전 냉각되어야 합니다.
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- 용화된 기저막 매트릭스와 접촉할 인슐린 주사기, 팁 및 튜브를 -20°C에서 식히십시오
.- 수행할 주입 횟수(~2 μL/주입)에 따라 얼음 위에 가용화된 기저막 매트릭스의 적절한 크기의 분취량을 해동합니다. 약 30분 정도 소요됩니다.
- 분취량이 해동되는 동안 세포를 쪼개고, 수확하고, 계산합니다.
- 주입당 필요한 부피를 계산합니다. 여러 번 주입하는 경우 총 부피의 세포를 1.5mL 튜브에 넣고 최대 1mL의 DMEM/F12.
참고: 손실/피펫팅 오류를 설명하기 위해 몇 번의 추가 주입이 가능한 부피를 사용해야 합니다. - 다음 단계가 준비되는 동안 세포를 얼음에 넣으십시오.
- 해동 후, 가용화된 기저막 매트릭스를 얼음처럼 차가운 DMEM/F12에서 최종 농도 3mg/mL로 희석합니다.
- 얼음에서 단일 세포 현탁액을 채취하여 4°C에서 5분 동안 300×g으로 회전시킵니다.
참고: 냉장 원심분리기를 사용할 수 없는 경우 일반적으로 실온에서 회전이 허용되는 것으로 보입니다. - 세포 펠릿을 방해하지 않고 배지를 부드럽게 완전히 제거합니다. 희석된 가용화 기저막 매트릭스(3mg/mL)에 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁하여 수행할 주입당 최종 부피 2μL를 얻은 다음 사용할 때까지 즉시 얼음 위에 다시 놓습니다.
참고: 세포의 재현탁은 기포와 겔화의 형성을 피하기 위해 미리 냉각된 팁을 사용하여 천천히 수행해야 합니다. - -20°C 냉동고에서 미리 냉각된 주사기를 얼음통으로 옮깁니다. 사용할 때까지 보관하십시오.
- 인큐베이터에서 뇌 오가노이드가 있는 플레이트를 제거합니다. 와이드 보어 팁을 사용하여 주입할 오가노이드를 35mm 접시로 옮깁니다. 오가노이드를 안정화하고 주입을 용이하게 하기 위해 오가노이드를 손상시키지 않고 가능한 모든 배지를 제거합니다.
참고: 오가노이드가 파괴되지 않도록 넓은 구경 팁을 사용하는 것이 중요합니다. 사용할 수 없는 경우 멸균 가위로 일반 P1,000 팁의 끝을 자릅니다 .- 오가노이드가 들어 있는 35mm 접시를 해부 현미경 아래에 놓아 주입을 안내하고 용이하게 합니다.
참고: 멸균 구역에서 해부 현미경을 사용할 수 없는 경우, 제어가 다소 감소하더라도 현미경 없이 주사를 수행할 수 있습니다. 또 다른 대안은 확대 루프 또는 안경을 사용하는 것입니다. - 오가노이드(들)를 주입할 준비가 되면 냉각된 P20 피펫 팁으로 세포를 부드럽게 재현탁하고 2μL(주입할 원하는 수의 세포 포함)를 사전 냉각된 멸균 유리 슬라이드 위로 이동합니다.
참고: 여러 번 주입하는 경우 유리 슬라이드 전체에 2μL 부피를 추가할 수 있습니다. 얼음 위에 보관하고 증발하지 않도록 주의하십시오. - 얼음에서 미리 식힌 인슐린 주사기를 꺼내 바늘의 경사가 아래를 향하도록 2μL의 세포 현탁액을 천천히 끌어올려 모든 세포/배지가 흡수되도록 합니다.
참고: 공기가 빨려 들어가지 않도록 매우 천천히 진행해야 합니다. - 오가노이드가 들어 있는 접시의 뚜껑을 열고 현미경으로 초점을 맞춥니다. 한 손으로 접시를 잡습니다. 바늘의 경사를 위로 올리고 다른 손으로 세포를 오가노이드 표면에 천천히 주입합니다.
참고: 조직 손상을 방지하기 위해 천천히 주입하는 것이 중요합니다. - 주입 후 뚜껑을 접시에 다시 넣고 주입된 오가노이드를 1-2분 동안 그대로 두십시오.
참고: 이렇게 하면 희석되고 가용화된 기저막 기질이 겔화되어 세포를 제자리에 고정할 수 있습니다. 배지를 너무 일찍 첨가하면 표면에 있는 세포가 씻겨 나갈 수 있습니다. - 500μL의 오가노이드 배지를 부드럽게 첨가하고 와이드 보어 팁이 있는 오가노이드를 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 오가노이드를 37°C 및 5% CO2에서 밤새 배양합니다. 이틀에 한 번씩 완전한 배지 변경을 수행합니다.
참고: 이미징 조정에 사용될 음성 대조군 오가노이드(모의 주사)를 포함하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 희석된 가용화 기저막 매트릭스(3mg/mL)와 함께 이전에 설명한 대로 오가노이드를 주입하여 세포 없이 2μL의 최종 부피를 얻습니다.
