티오플라빈 T 형광을 이용한 박테리아 감염 유도 아밀로이드 정량

초록

출처: Balczon, R., et al. 녹농균에 의한 폐내피 세포 감염 후 세포독성 아밀로이드를 검출하는 방법. J. Vis. 경험. (2018년)

이 비디오는 아밀로이드 베타 시트 구조에 결합하는 형광 염료인 티오플라빈 T를 사용하여 독성 박테리아에 감염된 폐 내피 세포의 배양 상청액에서 아밀로이드를 정량화하는 프로토콜을 보여줍니다. 기준선에 비해 형광의 증가는 배양 상청액에 아밀로이드가 존재함을 나타냅니다.

프로토콜

1. 세포독성 상청액 분석

1. 티오플라빈 T(ThT) 분석을 수행하려면 ThT 형광을 사용하여 상청액의 아밀로이드를 정량화합니다. 이러한 측정에는 필터 멸균된 상청액을 사용하십시오.
   1. 10mL 인산염 완충 식염수(PBS)에 8mg ThT를 현탁시켜 ThT의 원액(50x)을 준비합니다. 혼합 후 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과하여 미립자를 제거합니다.
   2. 측정을 위해 1mL 분광 광도계 큐벳에서 1mL의 PBS에 20μL의 ThT 스톡을 추가합니다. 희석된 샘플을 분광형광계에 넣습니다.
   3. 425nm 여기를 사용하여 기준선 형광 방출을 측정하고 450-575nm에서 형광 방출을 2nm 단위로 스캔합니다.
   4. 425nm 여기 및 482nm 방출을 사용하여 타임랩스 스캔을 수행하고 60초 동안 0.2초마다 데이터를 수집합니다.
   5. 타임랩스 스캔의 초기 20초는 빈 큐벳에서 형광을 측정합니다. 20초에 스캔을 일시 중지하고 필터로 멸균된 상청액 10μL를 큐벳에 추가합니다. 큐벳을 반전시켜 혼합한 다음 분광형광계에 다시 넣습니다.
   6. 시간 기반 스캔을 재개하여 마지막 40초의 데이터를 수집합니다.
   7. 타임랩스 스캔이 완료되면 1.3단계에 설명된 대로 동일한 설정을 사용하여 최종 형광 방출 스펙트럼 스캔을 수행합니다.

재료