박테리아 균주 간의 경쟁적 상호 작용을 연구하기 위한 공동 배양 분석

초록

출처: Speare, L., et al. Vibrio fischeri 분리주 간의 경쟁적 상호 작용을 정량화하기 위한 공동 큐베이션 분석. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 박테리아 균주가 공유 환경에서 어떻게 경쟁하는지 연구하는 데 사용되는 공동 배양 분석을 보여줍니다. 이러한 상호 작용을 유도하는 접촉 의존적 또는 접촉 독립적 사멸과 같은 메커니즘을 식별하기 위해 미생물학에 널리 적용됩니다.

프로토콜

1. 공동 배양 균주(그림 1B, C)
   1. 라벨이 부착된 1.5mL 원심분리기 튜브에 각 균주 100μL(OD 1.0으로 정규화됨)를 첨가하여 참조 균주와 경쟁 균주를 1:1 비율(v/v)으로 혼합합니다. 대조군으로서, 기준 균주를 차등적으로 태그된 버전(기준 균주 pVSV102 + 기준 균주 pVSV208)과 혼합합니다. 이 대조군은 경쟁 균주의 존재가 참조 균주의 성장에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위한 이후 통계 분석에 필요합니다. 혼합 균주 배양을 1-2초 동안 소용돌이치게 합니다.
      메모: 시작 비율이 결과에 큰 영향을 미칠 수 있고 조정해야 할 수 있으므로 이 단계에서는 최적화가 필요할 수 있습니다.
   2. 각 생물학적 복제에 대해 1단계를 반복합니다. 이 단계를 완료한 후에는 총 8개의 혼합 균주 튜브가 있어야 합니다: 차등 태그가 지정된 참조 균주가 있는 4개의 생물학적 복제(대조군), 차등 태그가 지정된 참조 및 경쟁 균주가 있는 4개의 생물학적 복제(실험적).
   3. 각 대조군 및 실험 혼합물 10μL를 LBS 한천이 포함된 페트리 플레이트에 떨어뜨립니다. 이 배양 지점은 배양 후 형광 현미경 검사에 사용됩니다.
   4. 모든 액체가 한천에 흡수될 때까지 벤치에서 반점을 완전히 건조시키고 페트리 플레이트를 24°C에서 24시간 동안 배양합니다. pVSV102 및 pVSV208로 태그된 V. fischeri 균주가 형광 해부 현미경을 사용하여 집단 수준에서 각각 녹색 형광 단백질(GFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)을 시각화할 수 있을 만큼 충분히 높은 세포 밀도로 성장하려면 최소 15시간이 필요합니다. 여기에서는 혼합 스팟을 이미징하기 위해 24시간 배양을 사용합니다.
      메모: 너무 촉촉하거나 너무 건조하지 않은 접시를 사용하는 것이 중요합니다. 플레이트가 너무 촉촉하면 공동 부양 지점이 한천 플레이트에 흡수되지 않습니다. 당일 부은 접시를 사용하지 마십시오. 플레이트가 너무 건조하면 한천 표면에 작은 물결이나 균열이 형성되어 공동 부화 반점의 모양이 불규칙해질 수 있습니다.

결과

그림 1: 공동 배양 분석을 보여주는 순서도. (A) pVSV102(참조 균주, 참조 균주 또는 RS) 또는 pVSV208(경쟁 균주, Comp. 균주 또는 CS)을 포함하는 박테리아 균주는 참조 균주(LBS Kan) 또는 경쟁 균주(LBS Cam)에 대해 선택적인 배지에서 별도로 성장합니다. 그런 다음 균주를 LBS 국물에 재현탁하고 OD = 1.0으로 정규화합니다. (B) 기준 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	어부	05-408-129
10 μL 멀티채널 피펫
100 μL 멀티채널 피펫
300 μL 멀티채널 피펫
10 μL 단일 채널 피펫
20 μL 단일 채널 피펫
200 μL 단일 채널 피펫
1000 μL 단일 채널 피펫
24웰 플레이트	어부	07-200-84	뚜껑이 있는 멸균
페트리 플레이트	어부	FB0875713	뚜껑이 있는 멸균
TipOne 0.1-10 μL 스타터 시스템	미국 사이언티픽	1111-3500	랙 10개
TipOne 200 μL 스타터 시스템	미국 사이언티픽	1111-500	랙 10개
TipOne 1000 μL 스타터 시스템	미국 사이언티픽	1111-2520	랙 10개
LBS 미디어
1M 트리스 완충액 (pH ~7.5)			50mL 1M 스톡 완충액(62mL HCl, 938mL DI 물, 121g Trizma Base)
한천	테크니컬 피셔	DF0812-17-9	15g (접시에만 추가)
DI 물			950 밀리미터
소금	어부	S640-3	20 그램
트립톤	어부	BP97265	10g
효모 추출물	어부	BP9727-2	5 그램