도금 분석 및 유세포 분석을 사용한 대장균 의 항생제 유도 필라멘션 평가

초록

출처: Cayron, J. 및 Lesterlin, C. 스트레스 치료 하에서 박테리아 성장에 대한 다중 규모 분석. J. Vis. 경험. (2019년)

이 비디오는 도금을 사용하여 생존율을 측정하고 유세포 분석을 사용하여 세포 분열 억제 항생제 처리에서 대장균 필라멘트 및 DNA 복제를 평가하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 도금 분석

메모: 도금 분석은 배양 샘플에서 콜로니 형성 단위(CFU)를 생성할 수 있는 세포의 농도를 측정합니다. 이 절차는 하나의 세포가 두 개의 생존 가능한 세포로 분열하는 속도를 밝히고 세포 분열 정지(예: 세포 용해의 박테리아 생성 시간 증가)를 감지할 수 있습니다.

1. 신선한 배지에서 200μL의 배양 샘플 중 최대 ^10-7 까지 10배 연속 희석액을 준비합니다. 37°C에서 하룻밤 배양 후 3-300 콜로니 사이의 콜로니를 얻기 위해 비선택적 Luria-Bertani(LB) 아가로스 플레이트에 적절한 희석액 100μL를 플레이트합니다. 참고: 박테리아 분열을 제한하기 위해 신선한 배지에서 연속 희석을 신속하게 수행해야 합니다. 또는 연구자들은 희석 과정에서 세포 분열을 방지하기 위해 탄소원이 없는 식염수 사용을 고려할 수 있습니다.
2. 다음날, 콜로니 수를 세어 각 배양 샘플에서 생존 세포의 농도(CFU/mL)를 결정합니다. CFU/mL를 처리되지 않은 세포 배양과 처리된 세포 배양의 시간 함수로 플로팅합니다.

2. 유세포 분석

메모: 다음 섹션에서는 유세포 분석을 위한 세포 샘플의 준비에 대해 설명합니다. 이 분석 기술은 많은 수의 세포에 대한 세포 크기와 DNA 함량의 분포를 보여줍니다. 가능하면 유세포 분석 샘플을 즉시 처리하는 것이 좋습니다. 또는 샘플을 얼음 위에 보관하고(최대 6시간 동안) 도금 및 현미경 이미징이 수행된 후 하루가 끝날 때 동시에 분석할 수 있습니다.

1. 250μL의 배양 샘플을 희석하여 4°C의 신선한 배지에서 ~15,000 cells/μL(OD_600nm ~0.06에 해당)의 농도로 250μL를 얻습니다.
   메모: 얼음 위에서 배양하면 세포의 성장과 형태학적 변형이 제한됩니다. 또는 사용자는 일반적으로 유세포 분석에 권장되는 것처럼 75% 에탄올에 세포를 고정하는 것을 고려할 수 있습니다.
2. DNA 염색의 경우, 박테리아 시료를 10μg/mL의 DNA 형광 염료 용액(비율 1:1)과 혼합하고 시료를 분석하기 전에 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다.
3. 샘플을 ~120,000 cells/min 유속으로 유세포 분석기에 통과시킵니다. 적절한 설정을 사용하여 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 광과 DNA 형광 염료 형광 신호(FL-1)를 획득합니다.
4. FSC 및 FL-1 세포 밀도 히스토그램을 플로팅하여 세포 집단의 세포 크기 및 DNA 함량 분포를 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	바이오래드	1613100	인증된 분자 생물학 아가로스
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