미생물 미세액방울 배양 시스템을 이용한 박테리아의 적응 진화

Abstract

출처: Jian, X., et al., MMC(Microbial Microdroplet Culture System)를 사용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화. J. Vis. 경험. (2022).

이 비디오는 미생물 미세 액적 배양 시스템을 사용하여 메탄올 내성을 향한 박테리아의 적응 진화를 유도하는 방법을 보여줍니다. 조작된 박테리아 배양액을 높은 메탄올 스트레스 배지와 혼합하고 이를 미세 물방울로 분할함으로써 시스템은 메탄올 스트레스 하에서 향상된 성장을 보이는 돌연변이를 선택합니다. 반복적인 농축 주기와 콜로니 분리를 통해 추가 분석 또는 적용을 위해 메탄올 적응 박테리아 균주를 배양합니다.

Protocol

MMC의 적응 진화

1. 초기 박테리아 용액 준비
   1. 관련 표준 규정에 따라 MeSV2.2용 특수 액체 매체 및 고체 플레이트를 준비하고 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다.
   2. 고체 플레이트(직경 = 90mm)를 사용하여 37°C 항온 인큐베이터에서 72시간 동안 MeSV2.2를 배양합니다. 그런 다음 독립적인 콜로니를 선택하고 37°C의 진탕 인큐베이터(200rpm)에서 72시간 동안 10mL의 특수 액체 배지와 함께 50mL 쉐이크 플라스크에서 배양합니다.
   3. 배양된 MeSV2.2 용액을 배지로 OD₆₀₀ 0.1-0.2로 희석하고(총 부피가 10mL 이상인지 확인) 쉐이크 플라스크에서 5시간 동안 계속 배양하여 초기 박테리아 용액을 얻습니다.
      메모: MeSV2.2는 메탄올 필수 대장균 균주입니다. 특수 액체 배지에는 500mmol/L 메탄올이 포함되어 있는데, 이는 MeSV2.2에 강한 스트레스가 되어 성장이 매우 느립니다..
2. MMC를 초기화합니다.
3. 멸균된 시약 병 두 개를 꺼내는데, 그 중 하나는 초기 박테리아 용액용이고 다른 하나는 신선한 배지용입니다. 초기 박테리아 용액(5mL), 신선한 배지(12-15mL) 및 MMC 오일을 시약 병에 주입합니다.
   메모: 적응 진화는 여러 하위 재배를 포함하는 장기적인 과정이므로 MMC에 가능한 한 많은 신선한 배지를 저장하십시오. 실험 중에는 배지를 보충할 수 없습니다.
4. 두 개의 시약 병을 MMC에 설치합니다. 하나는 C2와 O2 커넥터 사이의 초기 박테리아 용액용이고 다른 하나는 C4와 O4 커넥터 사이의 신선한 배지용입니다.
5. ALE를 클릭하여 적응 진화 기능을 선택합니다 (그림 1B). 매개변수 설정 인터페이스에서 OD 감지 스위치를 켭니다.

6. 숫자를 50, 파장을 600nm, 농도를 0%, 유형을, 매개변수를 30시간으로, 반복을 99로 설정합니다. 시작을 클릭하여 드롭릿 생성을 시작합니다. 소요 시간은 약 25분입니다.
   메모: 여기서 "농도"는 적응 진화를 위한 화학적 요인의 최대 농도를 의미합니다. 다양한 액적의 경우 MMC에서 다양한 성장 조건을 제공하기 위해 다양한 농도의 화학 인자를 도입하는 것이 가능합니다. 다음 방정식을 사용하여 도입된 농도를 계산합니다.

   

   여기서 "C" 는 물방울에 도입된 화학적 요인의 농도를 나타냅니다. "a"는 C4와 O4 커넥터 사이의 시약 병에 있는 화학 인자의 농도를 나타냅니다. "b"는 C6과 O6 커넥터 사이의 시약 병에 있는 화학 인자의 농도를 나타냅니다. "i"는 사용 가능한 농도를 나타냅니다. MMC에는 8가지 농도가 있습니다. 여기서의 화학계자는 단일 농도(500mmol/L 메탄올)이고 배지의 성분 중 하나이기 때문에 여기에는 화학계자를 함유한 시약병 하나만 설치하고 농도는 0%로 설정한다. 유형은 하위 재배 모드를 말하며 시간 모드, OD 값 모드 및 형광 모드의 세 가지 유형으로 나뉩니다. 전자는 액적을 일정 시간 동안 배양한 후 과대 배양하는 것을 의미하고, 후자의 두 가지는 물방울을 미리 정의된 OD 값/형광 강도로 배양한 후 과대 배양하는 것을 의미합니다. 매개변수는 하위 재배 모드를 선택할 때 필요한 관련 매개변수를 나타냅니다. 반복은 하위 재배의 수를 나타냅니다.

7. C2 및 O2 커넥터 사이에 놓인 시약병을 제거합니다.
8. 각 하위 배양 기간 동안 물방울의 최대 OD 값이 크게 증가했는지 관찰합니다. 증가가 발생하고 실험 요구 사항을 충족하는 경우 데이터 내보내기 버튼을 클릭하여 OD 데이터를 내보냅니다.
   참고: 여기서 하위 재배 기간은 매개변수에 따라 다릅니다. 예를 들어, 유형을 시간으로 설정하고 매개변수를 30시간으로 설정하면 하위 재배 기간은 30시간입니다. 각 하위 재배 기간 동안 물방울의 최대 OD 값이 있습니다. 적응 진화가 최대 OD 값의 증가로 실험 요구 사항을 충족하는지 여부를 추정합니다(증가는 균주의 실제 재배 과정에 따라 다름, 예를 들어 20% 이상 증가). 주의 : 보관된 신선한 배지가 소진되었는지 주의하십시오. 배지가 고갈된 후에도 상당한 증가가 발생하지 않으면 더 잘 자라는 물방울을 추출하고 새로운 적응 진화를 수행합니다.
9. MMC에서 대상 물방울을 추출합니다.
   1. 스크리닝 버튼을 클릭하여 액적 추출 기능을 선택합니다 (그림 1C). 수집 옵션을 선택하고 대상 물방울 수를 클릭한 다음 확인을 클릭합니다.
      메모: 액적 스크리닝에는 "수집", "폐기" 및 "종자 용액 추출"이 포함됩니다. "추출 종자 용액"은 하위 재배 작업 후 남은 물방울을 수집하는 것을 의미합니다.
   2. 팝업 창이 "CF 퀵 커넥터를 당겨 EP 튜브에 넣으십시오"라는 메시지가 나타날 때까지 기다립니다. 소프트웨어 프롬프트에 따라 수집을 위해 CF 퀵 커넥터를 미세 원심분리기 튜브에 넣은 다음 확인을 클릭합니다(그림 2D).
   3. 1-2분 후에 소프트웨어 인터페이스에 "커넥터를 다시 삽입하고 완료되면 확인을 클릭하십시오"라는 새 창이 나타납니다. 그런 다음 CF 퀵 커넥터를 다시 삽입하고 확인을 클릭하여 MMC가 계속 실행되도록 합니다(그림 2D).
      메모: 모든 대상 물방울이 수집된 후 MMC는 나머지 물방울을 계속 배양합니다. 재배가 필요하지 않은 경우 중지를 클릭하여 작업을 직접 종료합니다.
   4. 2.5μL 피펫을 사용하여 물방울을 추출하여 90mm 아가로스 플레이트에 떨어뜨린 다음 한 변 길이가 3cm인 삼각형 유리 살포 막대로 고르게 펴 바릅니다. 그런 다음 37°C 항온 인큐베이터에서 72시간 동안 배양합니다.
   5. 3-5개의 독립적인 콜로니를 선택하고 37°C에서 48-72시간 동안 진탕 인큐베이터(200rpm)에서 10mL의 신선한 배지와 함께 50mL 쉐이크 플라스크에서 별도로 배양합니다. 관련 표준 규정에 따라 후속 실험을 위해 배양된 박테리아 용액을 글리세롤 튜브에 보관하십시오.

Results

그림 1: MMC의 작동 소프트웨어 인터페이스. (A) 소프트웨어의 기본 인터페이스. (1) 수술실의 온도. (2) 물방울 인식의 광전 신호 값. 물방울이 통과하면 신호 값이 높습니다(>2V). 오일이 통과하면 신호 값이 낮습니다(<1V). (3) 기능 선택. 성장 곡선 측정(Growth Curve), 적응 실험실 진화(ALE), 단일 요인 다단계 분석(One-factor), 실...

Materials