박테리아 세포를 이용한 마이크로플루이딕 플레이트 준비

초록

출처: Sutlief, A. L. 외 자동화된 고처리량 마이크로유체 시스템을 이용한 Pseudomonas aeruginosa 의 전단 응력에 대한 생세포 분석. J. Vis. 경험 (2019).

이 영상은 박테리아 배양에서 전단 응력 연구를 위한 마이크로플루이딕 플레이트 준비 과정을 보여줍니다. 채널에 배지를 프라이밍한 후, 박테리아 세포를 실험 채널에 도입하여 부착을 위해 배양합니다. 잔류 배지와 배양물을 제거하여 이후 전단 응력 실험을 준비합니다.

프로토콜

1. 미디어 준비

1. 0.25% 포도당을 포함한 최소 배지(MM)를 준비합니다. 0.25% 포도당 MM 1L 제조를 위해 멸균 M9 염액 200 mL, 멸균 1 M 황산마그네슘 2 mL(MgSO₄), 멸균 1 M 염화칼슘₁₀₀ μL (CaCl 2), 그리고 멸균 20% 포도당(dH₂O)을 최종 부피 1L에서 첨가합니다.
2. 필요한 배지를 멸균 병에 멸균 기법을 사용해 옮겼습니다. 사용하는 채널 수에 따라 필요한 양을 준비하세요. 일반적으로 각 채널은 프라이밍에 200 μL, 시딩 시 300 μL, 24시간 실험에 1300 μL가 필요합니다.
3. 병을 인큐베이터나 실험 온도에 맞춘 물욕에 넣으세요. 마이크로채널에 기포가 생기지 않도록 배지는 사용 전에 실험 온도에 맞춰 있어야 합니다.

2. 강화된 녹색 형광 단백질(PA01-EGFP)을 발현하는 Pseudomonas aeruginosa 균주 PA01의 하룻밤 및 실험 배양 제제.

1. 멸균된 사이드암 플라스크에 실험용 배지 15mL를 넣고, PA01-EGFP가 줄인 한천 플레이트의 한두 개 콜로네이션으로 접종합니다. 배양액을 인큐베이터/셰이커 테이블에서 37°C, 180-220rpm에서 12-16시간 동안 확장하세요.
2. 오버나이트 배양 OD₆₀₀ 을 측정하세요. OD₆₀₀ 이 0.80을 초과할 때, 신선한 MM을 사용해 하룻밤 배양물을 최종 OD 0.8로 희석합니다. 실험 배양물을 37°C의 인큐베이터 또는 수욕에 넣어 미세유체 채널 파종에 필요할 때까지 보관합니다. 시딩 직전에 OD₆₀₀ 이 목표 OD₆₀₀(이 경우 0.8)에서 크게 변하지 않았는지 다시 확인하세요.

3. 장비 시작

1. 사용자 가이드에 따라 시스템 스테이션을 설정하는데, 그림 1의 설정과 유사합니다. 기기와 소프트웨어 연결 오류에 오류가 발생하지 않도록 다음 순서로 기기를 켜세요:
   PC 워크스테이션
   형광 모듈. 형광 셔터가 켜져 있는지 확인하세요 (셔터 버튼 옆에 있는 파란 불 켜짐)
   하드웨어 컨트롤러
   영상 시스템 컨트롤러 ( 재료표 참조)
   CCD 카메라
   이미징 스테이션 (현미경)
   참고: 가열판의 온도는 원하는 실험 온도로 조절해야 합니다.
2. 제어 적용을 시작하고 번호판 옆면의 라벨에 있는 번호판을 입력하세요.
   참고: 제어 애플리케이션이 시작되면 현미경/영상 소프트웨어를 제어하는 소프트웨어와 펌프 및 웰플레이트 인터페이스를 제어하는 제어 모듈용 두 개의 별도 애플리케이션 창이 있습니다.

4. 마이크로플루이딕 플레이트의 프라이밍 및 시딩

참고: 프라이밍, 씨앗 뿌리기, 박테리아 부착 및 성장 과정은 그림 2에 나와 있습니다.

1. 48웰 마이크로플루딕 플레이트를 포장에서 제거하되, 플레이트 하단의 유리 표면에 닿지 않도록 주의하세요. 유리 슬라이드 하단은 렌즈 티슈, 보풀 없는 천, 또는 저보풀 티슈로 깨끗이 닦으세요.
2. 마이크로플루이딕 채널을 프라이밍하기 위해, 기포를 피하고 37 °C MM 200 μL 피펫을 출력에 주입합니다. 플레이트를 플레이트 스테이지에 넣고 인터페이스에 에탄올을 닦아 건조시키고, 플레이트 스테이지에 밀봉합니다.
3. 제어 모듈의 수동 모드에서 유체를 다음과 같이 설정하세요
   루리아-베르타니(LB)는 37°C, 맥스 시어는 5.00 dyne/cm²에서 사용했습니다. 출력 우물을 클릭하면 출력에서 입력 우물로 흐름이 활성화되어 채널을 프라이밍합니다. 5분간 준비를 마친 후에는 시뿌리기 준비를 위해 흐름을 멈추세요. 스테이지에서 플레이트를 조심스럽게 분리하고 잔류 매체를 출력에서 피펫으로 제거하되, 마이크로플루이딕 채널로 이어지는 내부 원의 매체는 제거하지 마십시오.
4. 실험 채널에 시딩을 위해 먼저 300 μL MM을 입력 웰에 피펫팅한 후, 300 μL 박테리아 배양물을 출력 웰에 피펫 투입하여 출력 웰로 넣습니다. 플레이트를 다시 플레이트 스테이지에 넣고, 플레이트 위에 올리기 전에 인터페이스를 닦아내세요.
5. 제어 모듈에서는 플레이트 스테이지를 현미경 스테이지에 올린 후 라이브 카메라 피드를 사용해 단일 채널에 초점을 맞춥니다. 실시간 피드로 육안으로 모니터링하는 동안, 약 2-4초 동안 1.00-2.00 다이네/cm^² 로 유동을 재개하여 세포가 실험 채널에 들어갈 수 있도록 하되, 뱀 모양 채널에는 들어가지 않도록 합니다. 세포 부착을 위해 플레이트를 온도 조절 단계에 1시간 동안 두세요. 1시간 인큐베이션 동안 제어 모듈과 몽타주 소프트웨어를 자동 실행을 위해 설정할 수 있습니다.
   참고: 파종에 필요한 시간은 배지와 생물에 따라 다르므로, 최적화될 때까지 라이브 피드에서 면밀히 모니터링하여 일반적인 시간 프레임으로 사용해야 합니다. 판 전체에 걸쳐 시딩하는 방식이 다를 수 있어, 완전한 시딩을 위해 특정 채널 기둥에 흐르는 데 더 많은 시간이 필요합니다.
6. 부착 기간 후에는 플레이트를 부드럽게 스테이지에서 분리하고 먼저 배출구에서 박테리아를 피펫으로 제거하여 채널을 방해하지 않도록 하세요. 새 피펫 팁으로 입력 웰에서 매체를 제거하세요.

결과

그림 1: 마이크로유체 시스템의 개별 구성 요소들. 개별 부품은 왼쪽에서 오른쪽으로 나열되어 있습니다: 1. CCD 카메라, 2. 자동 스테이지, 자동 형광 모듈, 오토포커스 모듈을 갖춘 고해상도 역현미경, 3. 플레이트 스테이지, 4: 영상 시스템 인터페이스, 5: 수동 현미경 단계 제어, 6: 증기 트랩, 7: 영상 시스템 컨트롤러(온도 조절기 포함), 8: 하드웨어 컨트롤러, 9: 형광 컨트롤러, 10: 무정전 전원 공급...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화암모늄, ACS	VWR	BDH9208-500G	최소 미디어 구성의 일부입니다
BioFlux 1000 48웰 저전단판	플럭션 바이오사이언스	910-0047
바이오플럭스 1000Z 마이크로플루이딕 이미징 시스템	플럭션 바이오사이언스	BF 1000Z
염화칼슘 디하이드라이드, ACD 등급	VWR	97061-904	최소 미디어 구성의 일부입니다
포도당, 무수, ACS	VWR	BDH9230-500G	최소 미디어 구성의 일부입니다
마그네슘 설페이트 ACS 등급	VWR	EM-MX0070-1	최소 미디어 구성의 일부입니다
인산칼륨 단염기성, ACS 등급	VWR	BDH9268-500G	최소 미디어 구성의 일부입니다
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	이 연구에 GFP 변형을 적용한 Pseudomonas aeurinosa 박테리아 균주 PA01.
염화나트륨, ACS	VWR	BDH9286-500G	최소 미디어 구성의 일부입니다
인산나트륨, 단염기성, 무수, 시약등급	VWR	97061-942	최소 미디어 구성의 일부입니다