microRNA mimic 매개 게놈 साइ런싱을 통한 바이러스 확산 억제 평가

초록

microRNA 표적 특이성 평가: 합성 microRNA mimic을 이용한 바이러스 확산 분석 참고: microRNA와 microRNA 표적 간 상호작용의 특이성을 입증하기 위해 합성 microRNA mimic을 사용한다. microRNA 매개 독성을 평가하기 위해 모든 분석에 mock transfection, 음성 대조군 microRNA mimic, 실험군 microRNA mimic 단독 대조군을 반드시 포함하라. 또한 microRNA mimic의 낮은 transfection 효율로 인해 위음성 결과가 나올 수 있으므로, 양성 대조군(즉, microRNA 표적 유전자 또는 게놈)을 포함하는 것이 이상적이다. transfection 시점(분주 후 24시간)에 80-90% 합류도(confluency)가 되도록 H1-HeLa 세포를 96-well 조직 배양 플레이트에 분주한다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)을 well당 0.1 mL씩 넣어 세포를 분주한다. 참고: 이 분석은 해당 microRNA를 발현하지 않으면서 바이러스 복제가 가능한 세포에서 수행한다. transfection 시약을 실온으로 가온한다. 무혈청 배지 9 µL, well당 최종 농도 200 nM의 microRNA mimic 스톡, boost 시약 0.18 µL, transfection 시약 0.18 µL를 혼합한다. 혼합물을 실온에서 2-5분간 배양한다. 참고: 기재된 부피는 well당 기준이다. 일관성을 유지하고 피펫팅 오차를 최소화하기 위해 모든 well의 transfection을 위한 마스터 믹스를 조제하는 것을 권장한다. microRNA mimic의 최적 농도는 다를 수 있다. 적절한 시작 농도는 microRNA mimic에 동봉된 제조사 지침서를 참조하라. 일반적으로 최종 농도 5-200 nM 범위 내에서 결정된다. well에서 배지를 흡입하여 제거하고 92 µL의 신선한 완전 배지를 추가한다. 참고: 샘플 수가 많은 경우, transfection 용액을 조제하기 전에 이 단계를 완료하고 준비될 때까지 플레이트를 37 °C에서 보관한다. 전체 transfection 혼합물을 세포에 방울방울 첨가한다. 37 °C에서 6시간 동안 배양한다. 바이러스 확산을 분석할 수 있도록 낮은 비율의 세포만 감염되게끔 각 well을 낮은 MOI(Multiplicity of infection, 감염 다중도)로 감염시킨다. 본 프로토콜에서는 0.2의 MOI를 사용한다. 바이러스 스톡을 무혈청 배지로 희석하여 100 µL당 MOI = 0.2 농도로 만든다. well에서 배지를 제거하고 well당 100 µL의 바이러스 희석액을 추가한다. 37 °C에서 2시간 동안 배양한다. 각 well에서 배지를 흡입하여 제거하고 100 µL의 신선한 완전 배지를 추가한다. 37 °C에서 20-22시간 동안 배양한다. 상청액 내의 바이러스 역가(titration)를 측정한다. 각 well에서 상청액을 수집하고 100 µL의 신선한 완전 배지로 교체한다. 참고: 부유 세포를 사용하는 경우, 다음 단계에서 얻은 세포 펠릿을 100 µL의 신선한 완전 배지에 재현탁하여 생존능 분석을 위해 샘플 well로 되돌려 놓는다. 수집한 상청액을 4 °C에서 300 x g로 5분간 원심분리하여 세포 잔해를 제거한다. 정제된 상청액을 새 튜브로 옮기고, 해당 microRNA를 발현하지 않는 허용 세포(permissive cells)에서 감염성 바이러스의 역가를 측정한다. 참고: 감염력 손실을 방지하기 위해 모든 샘플을 얼음 위에 보관하라. Ruiz, A. J. 및 Russell, S. J. microRNA 기반의 Picornavirus 친화성 조절. J. Vis. Exp. (2017)

이 비디오는 배양된 상피 유사 세포에서 바이러스 복제를 선택적으로 억제하기 위해 합성 microRNA mimic을 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 microRNA 유도 게놈 침묵(genome silencing)이 어떻게 바이러스 확산을 차단할 수 있는지, 그리고 하위 감염성 분석을 통해 타겟팅 특이성을 확인하는 방법을 강조합니다.

프로토콜

1. microRNA 표적 특이성 평가: 합성 microRNA mimic을 이용한 바이러스 확산 분석

참고: 합성 microRNA mimic의 사용은 microRNA와 microRNA 타겟 간 상호작용의 특이성을 보여주기 위해 수행됩니다.

1. microRNA 매개 독성을 평가하기 위해 모든 분석에 mock transfection, 음성 대조군 microRNA mimic 및 실험군 microRNA mimic 전용 대조군을 포함하십시오. microRNA mimic의 낮은 transfection 효율은 위음성 결과로 이어질 수 있으므로 양성 대조군(즉, microRNA 표적 유전자 또는 게놈)을 포함하는 것이 이상적입니다.
2. transfection 시점에 세포 밀도가 80-90%가 되도록(분주 후 24시간) 96-well 조직 배양 플레이트에 H1-HeLa 세포를 분주하십시오. 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium)을 well당 0.1 mL씩 넣어 세포를 분주합니다.
   참고: 이 분석은 해당 microRNA를 발현하지 않으며 바이러스 복제가 가능한 세포에서 수행하십시오.
3. transfection 시약을 상온으로 가온합니다. 9 µL의 serum-free media, well당 최종 농도 200 nM의 microRNA mimic stock, 0.18 µL의 boost reagent, 0.18 µL의 transfection reagent를 혼합합니다. 혼합물을 상온에서 2-5분 동안 배양합니다.
   참고: 기재된 부피는 well당 기준입니다. 일관성을 유지하고 피펫팅 오차를 최소화하기 위해 모든 well의 transfection을 위한 master mix를 조제하는 것을 권장합니다. microRNA mimic의 최적 농도는 다를 수 있습니다. 적절한 시작 농도는 microRNA mimic에 동반된 제조사 지침을 참조하십시오. 이는 일반적으로 최종 농도 5-200 nM 범위입니다.
4. well에서 배지를 흡입하여 제거하고 92 µL의 신선한 완전 배지를 추가합니다.
   참고: 샘플 수가 많은 경우, transfection 용액을 조제하기 전에 이 단계를 완료하고 준비가 될 때까지 플레이트를 37 °C에서 보관하십시오.
5. 전체 transfection 혼합물을 세포에 한 방울씩 천천히 첨가합니다.
6. 37 °C에서 6시간 동안 배양합니다.
7. 바이러스 확산 분석이 가능하도록 낮은 비율의 세포만 감염되게 하기 위해, 각 well을 낮은 MOI (Multiplicity of infection)로 감염시킵니다. 본 프로토콜에서는 0.2의 MOI를 사용합니다.
   1. 바이러스 stock을 serum-free media로 희석하여 100 µL당 MOI = 0.2 농도로 만듭니다. well에서 배지를 제거하고 well당 100 µL의 희석된 바이러스를 첨가합니다.
   2. 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.
8. 각 well에서 배지를 흡입하여 제거하고 100 µL의 신선한 완전 배지를 첨가합니다.
9. 37 °C에서 20-22시간 동안 배양합니다.
10. 상층액의 바이러스 역가를 측정합니다.
    1. 각 well에서 상층액을 수집하고 100 µL의 신선한 완전 배지로 교체합니다.
       참고: 부유 세포를 사용하는 경우, 다음 단계에서 얻은 세포 pellet을 100 µL의 신선한 완전 배지에 재현탁하여 생존력 분석을 위해 샘플 well로 되돌려 놓으십시오.
    2. 수집한 상층액을 4 °C에서 300 x g로 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
    3. 정제된 상층액을 새 튜브로 옮기고 해당 microRNA를 발현하지 않는 허용 세포에서 감염성 바이러스의 역가를 측정합니다. 
       참고: 감염력 상실을 방지하기 위해 모든 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nuclease-free water	Fisher Scientific	AM9938
TransIT-2020 Transfection reagent	Mirus	MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection reagent	Mirus	MIR 2225
2 mL 스크류 캡 튜브	Sarstedt	72.694.005
MicroRNA mimics	Dharmacon	Varied
MTT 세포 증식 분석 키트	ATCC	30-1010K