면역조절제를 인코딩하는 바이러스 벡터의 복제 및 세포독성 능력 결정 생성된 재조합 바이러스와 수정되지 않은 벡터의 복제 역학을 단일 단계 또는 다단계 성장 곡선(GC)으로 비교하십시오. 단일 단계 GC의 경우, 모든 세포를 동시에 감염시킨 후(이론적으로 100% 감염) 바이러스 자손을 평가합니다. 다단계 GC는 낮은 비율의 세포 감염에서 시작하여 여러 차례의 바이러스 복제 과정을 추적합니다. 홍역 바이러스의 복제 역학 분석을 위해, 감염 전날 12-웰 플레이트의 웰당 10% FBS(소태아 혈청)가 포함된 1mL의 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 1 x 10^5개의 Vero 세포를 분주하십시오. 관심 있는 각 시간대별로 최소 두 개의 웰을 기술적 반복구로 준비하십시오. Vero 세포에서의 복제를 위해, 다단계 GC의 경우에는 낮은 MOI(감염 다중도)로, 단일 단계 GC의 경우에는 높은 MOI로 세포를 감염시키십시오(MV 또는 홍역 바이러스의 경우 각각 0.03 및 3). 배지를 각각의 바이러스 양이 포함된 300µL의 무혈청 배지로 교체하고 37°C, 5% CO2 조건에서 최소 2시간 동안 배양하십시오. 접종액을 제거하고 10% FBS가 포함된 1mL의 DMEM을 추가한 후 배양을 계속하십시오. 감염 후 12, 24, 36, 48, 72, 96시간과 같은 관련 시간대에, 세포를 배지로 직접 긁어내어 바이러스 자손을 수확하십시오. 각 웰의 내용물을 개별 튜브로 옮기고 액체 질소로 급속 냉동한 후, 적정 전까지 -80°C에서 보관하십시오. 참고: 평균 역가 분석을 위해 이 단계에서 반복 시료를 합칠 수 있습니다. 모든 시간대의 시료를 수집하십시오. 바이러스 자손 평가를 위해 37°C에서 동시에 해동하십시오. 볼텍싱 후 2,500 x g, 4°C에서 5분간 원심 분리하여 세포 파편을 펠렛화하십시오. 위에서 설명한 대로 각 제작물 및 시간대의 평균 역가를 계산하십시오. 시간에 따른 역가를 도식화하십시오. 외래 유전자가 삽입된 벡터와 삽입되지 않은 벡터, 서로 다른 외래 유전자가 삽입된 벡터, 또는 서로 다른 위치에 외래 유전자가 삽입된 벡터의 성장 곡선을 비교하십시오(그림 1 참조). Heidbuechel, J. P., 외 등종양 표적 면역 조절을 위한 파라믹소바이러스: 설계 및 엑스 비보(Ex Vivo) 평가. J. Vis. Exp. (2019).
이 영상에서는 바이러스 복제를 연구하기 위해 유전적으로 조작된 바이러스를 신장 상피 세포에 감염시켜 생산하고 수확하는 과정을 보여줍니다.
