분리된 면역 조절제의 면역학적 기능을 평가합니다. 다음은 젖산 탈수소효소(LDH) 방출 분석법을 통해 이중 특이성 T세포 인게이저(BTE)에 의해 유도된 세포 매개 세포독성을 평가하는 상세 방법을 설명합니다. 실험 중에 테스트할 조건을 결정하십시오(그림 1 참조). 시간대(시간에서 일 단위), 면역 조절제의 농도(pg/mL에서 µg/mL), 그리고 작동 세포 대비 표적 세포(E:T) 비율(예: 1:50에서 50:1 사이)을 다양하게 설정할 수 있습니다. 샘플은 항상 3반복으로 준비하십시오. BTE 단백질과 작동 세포가 없는 샘플, 단일 세포 유형(Tsp 및 Esp)의 자발적 LDH 방출 대조군, 판독 전 계면활성제를 첨가한 표적 세포 최대 용해 대조군(Tmax), 배지만 포함된 대조군, 그리고 Tmax를 위한 부피 대조군을 포함하십시오. 참고: 필요한 표적 세포 수와 배양 시간은 다를 수 있습니다. 최적의 파라미터를 식별하기 위해 작동 세포와 면역 조절제 없이 초기 테스트 런을 수행하십시오. 다양한 세포 수와 시간대를 평가하기 위해 Tsp 및 Tmax 샘플과 해당 대조군을 포함하십시오. 면역 작동 세포를 분리하십시오(예: 인간 혈액의 밀도 구배 원심분리를 통해 말초혈액 단핵구(PBMC)를 얻거나, 마우스 비장세포에서 마우스 T세포를 음성 선택법으로 분리). 표적 세포(예: 웰당 5 x 10³)를 U-바닥 96-웰 플레이트에 분주하십시오. 원하는 농도로 분리된 단백질을 각 샘플에 첨가하십시오. 원하는 비율로 면역 작동 세포를 첨가하십시오. 웰당 총 부피가 100 µL가 되도록 배지를 첨가하십시오. 결정된 시간 동안 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하며, 일반적으로 4에서 48시간 사이입니다(자극되지 않은 PBMC는 24시간, 갓 분리한 마우스 T세포는 48시간이며, 사전 자극된 면역 세포의 경우 더 짧은 배양 시간이 적용될 수 있습니다). 샘플 수집 45분 전에 Tmax 샘플과 해당 배지 대조군이 포함된 웰에 10x 용해 용액 10 µL를 첨가하십시오. 배양을 계속하십시오. 250 x g에서 4분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 각 상층액 50 µL를 평평한 바닥의 96-웰 플레이트로 옮기십시오. 세포에 결합된 LDH를 방지하기 위해 세포는 옮기지 마십시오. 제조사의 지침에 따라 기질 용액을 준비하십시오. 각 웰에 50 µL를 첨가하고 실온[RT]의 암실에서 30분 동안 또는 Tmax 샘플이 진한 빨간색으로 변할 때까지 배양하십시오. 각 웰에 정지 용액 50 µL를 첨가하십시오. 4,000 x g에서 1분 동안 원심 분리하고 중공 바늘을 사용하여 수동으로 공기 방울을 제거하십시오. 490 nm에서 광학 흡광도를 측정하십시오. 각 샘플에 대해 % 특이적 용해 값을 계산하십시오. 용해 용액이 있는 경우와 없는 경우의 배지 대조군 반복구의 평균을 계산하십시오. 얻어진 값을 각각 실험 샘플과 Tmax 및 자발적 방출 대조군에서 뺍니다. 이후 계산에는 이 배경 보정된 값을 사용하십시오. 배경 보정된 Tmax, Tsp, Esp 대조군의 평균을 계산하십시오. 이 평균값들을 사용하여 다음 식을 통해 각 샘플의 특이적 용해 백분율을 구합니다. % 특이적 용해 값을 단백질 농도 또는 E:T 비율에 대해 도식화하고 비표적 대조군 샘플과 비교하십시오. Heidbuechel, J. P., 등종양 표적 면역 조절을 위한 파라믹소바이러스: 엑스 비보(Ex Vivo) 설계 및 평가. J. Vis. Exp. (2019).
이 영상에서는 바이러스로 인코딩된 이중특이성 T세포 결합체(BTE)의 표적 특이적 면역 조절 활성을 평가하기 위한 세포 기반 분석법을 보여줍니다. BTE는 표적 수용체를 발현하는 종양 세포와 T세포를 연결하여 종양 용해 및 효소 방출을 유도합니다. 기질 전환에 기반한 비색 분석법을 통해 T세포 활성화를 확인할 수 있습니다. 테스트 샘플에서 색 강도가 더 높게 나타나면 BTE에 의해 매개된 수용체 특이적 면역 결합이 이루어졌음을 확인하는 것입니다.
