RNA 감염력 및 바이러스 수율 측정 BHK-21(baby hamster kidney-21) 세포를 150 mm 배양 접시에 접시당 3 × 106 cells의 밀도로 분주하여 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한다. 참고: BHK-21 세포는 10% 태아 송아지 혈청, 2 mM 글루타민, 비타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 alpha 최소 필수 배지(alpha minimum essential medium)에서 유지한다. 세포 단층을 차가운 용액 A(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4) 10 ml로 헹군다. 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(trypsin-EDTA) 4 ml로 처리하여 세포를 접시에서 분리하고, 탁상 원심분리기를 이용하여 270 × g에서 2분간 원심분리하여 세포를 수집한다. 50 ml 원추형 튜브에 담긴 차가운 용액 A 50 ml로 세포 펠릿을 재부유시킨 후, 세포 현탁액을 270 × g에서 2분간 원심분리한다. 이 세척 과정을 3회 반복하며, 마지막 세척 후 세포 펠릿을 용액 A에서 2 × 107 cells/ml의 밀도로 재부유시킨다. 세포 현탁액 400 µl 분주액을 2 mm 간격 큐벳에서 합성 RNA 2 µg과 혼합하고, 최적의 전기천공 조건(980 V, 펄스 길이 99 µsec, 5회 펄스) 하에 전기천공기로 혼합물을 즉시 전기천공한다(그림 1C). 전기천공된 세포를 상온(RT)에서 10분간 방치한 후, 완전 배양 배지 600 µl가 들어 있는 1.7 ml 마이크로튜브로 옮긴다. 완전 배양 배지 1 ml에서 전기천공된 세포를 10배 단계 희석하여 준비하고, 각 희석액 100 µl 분주액을 6-웰 플레이트에 배양된 전기천공되지 않은 BHK-21 세포 단층(5 × 105) 위에 접종한다. 4-6시간 배양 후, 10% 태아 송아지 혈청을 포함하는 최소 필수 배지 내 0.5% 아가로스를 세포 위에 덮는다. 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 4일 동안 배양한다. 7% 포름알데히드로 고정하고 5% 에탄올 내 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 감염 중심(플라크)을 시각화한다(그림 2A). 선택 사항: 형광항체법(immunofluorescence assays)을 통해 트랜스펙션 후 18-20시간에 RNA 전기천공 세포의 일본뇌염 바이러스(JEV) 단백질 발현을 조사하고(그림 2B), 플라크 분석법(plaque assays)을 통한 바이러스 역가 측정을 위해 트랜스펙션 후 22시간 및 40시간에 RNA 전기천공 세포로부터 상층액을 수집한다(그림 2C). 윤, S. 등세균 인공 염색체: 양성 가닥 RNA 바이러스 연구를 위한 기능 유전체학 도구. J. Vis. Exp. (2015)
이 영상에서는 박테리아 인공 염색체 클론으로부터 전사된 합성 RNA로부터 감염성 일본뇌염 바이러스를 회복시키는 과정을 보여줍니다. 합성 RNA를 세포에 전기천공하여 바이러스 게놈이 새로운 비리온 생산을 유도하는 과정을 보여줍니다. 감염된 세포 단층에서 형성된 플라크를 통해 감염성 바이러스의 성공적인 회복을 확인할 수 있습니다.
