Collagenase 준비
- 아래 표에 표시된 최종 농도를 만들기 위해 50 ML 원뿔 및 추가 절연 버퍼로 collagenase를 달다. vortexing하여 collagenase를 해산.
(12 마우스 + 2 = 14 여분의 마우스 마우스 X 5 ML / 마우스 = 70 ML 총 collagenase 솔루션)
(70 ML X 0.5 MG / ML 또는 collagenase P의 총 0.3 MG / ML = 35 MG 또는 21 MG)변형 나이 Collagenase P (MG / ML) 시간 (분) C3H, Balb / C, B6 > 12주 0.8 17 C3H, Balb / C, B6 <= 12주 0.5 13 NOD, NOR, 비 > 12주 0.8 17 NOD, NOR, 비 <= 12주 0.5 17 - 얼음 각 유리관과 장소에 collagenase 솔루션 2 ML 하는걸. collagenase 추가 30g 바늘과 얼음의 장소 (모자 준비) 3 ML 각 5 ML의 주사기를로드합니다.
팽만
- 그냥 해부 전에 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 완전히 서부 유럽 표준시 만드는 ETOH의 70 %로 전신을 스프레이. 성기 영역에서 시작 V - insision하십시오. 꼬리가 당신을 멀리 직면되도록 마우스를 회전합니다.
- 열린 마우스의 왼쪽 변의를 제거합니다. 이것은 췌장과 일반적인 담즙 덕트를 노출합니다.
- 대장를 입력 collagenase 솔루션을위한 작은 주머니를 떠나, 담즙 덕트가 빼낸 부분, 작은 창자의 양쪽에 hemostat 클램프를 놓습니다.
- 담즙 방광에서 시작, 차가운 collagenase 솔루션 3 ML을 포함 30g 바늘 5 ML 주사기로 담즙 덕트를 통해 췌장을 급증.
- 본문에서 췌장을 제거하고 collagenase 솔루션 2 ML을 포함 siliconized 약병에 놓으십시오. 이 단계는 지방과 결합 조직의 컬렉션을 최소화, 신속하고 같이 정상적으로 가능한 이루어져야합니다.
- 다음 마우스로 얼음과 단계를 반복 3 병을 놓으십시오.
소화
- 각 병을 밀봉하고 37 ° C 물 욕조에 넣습니다. 13-17분 (시간이 동물의 변형과 연령에 따라 다릅니다)을 품어.
- 시간이 경과되면 적극적으로 병을 흔들. 췌장은 다투지한다.
- 멸균 1000 ML의 비커에 큰 살균 싱크 스트레이너를 통해 각각의 다이제스트를 붓고하고 강제로 버퍼를 세척과 함께 화면을 피펫. 특면 50 ML conicals 튜브로 요약 (3 pancreata/50 ML 관 : 경우 N = 12 최종 볼륨 200 ML을 만들고 4x50 ML 튜브로 하는걸 버퍼를 충분히 세척 사용). 희석은 불필요한 아일릿 소화를 피하기 위해 빠르게 얼음에서 수행되어야합니다.
- 스핀 다운 : 원심 분리기를 시작합니다. 그것이 1,300 rpm을 도달하면, 그것을 해제합니다.
- ~ 5 ML을 떠나, 표면에 뜨는를 대기음. 펠렛을 대기음하지 매우주의하십시오.
- Resuspend 펠렛은 손으로 적극적으로 도청에 의해, 다음 씻어 버퍼의 50 ML를 추가합니다.
- 스핀 다운 : 원심 분리기를 시작합니다. 그것이 1,300 rpm을 도달하면, 그것을 해제합니다.
- 세척 버퍼의 5 ML과 펠렛과 세척을 Resuspend.
- 15 ML 원뿔에 5 ML을 전송하고 상기, 스핀 다운.
- 가능한 완벽하게 뜨는을 대기음. (남은 버퍼 Ficoll의 밀도의 변화가 발생할 수 있습니다.)
Ficoll
신속하게 수행합니다. 장기 Ficoll 노출이 아일 레츠에 유해합니다.
- 펠렛 완전히 ficoll을 (깨지지 조직 ficoll에 resuspend하기가 어렵습니다)을 추가하기 전에 헤어 졌 있는지 확인하십시오.
- 적극적으로 vortexing으로 ficoll, 밀도 1.108, 7 ML에서 펠렛을 Resuspend.
- 1.096, 1.069, 1.037 후이 순서에 남아있는 밀도 각각의 ficoll 2ml 각각의 밀도 위에 레이어.
- OFF 휴식과 함께, 4도에서 1,800 rpm으로 15 분 동안 스핀!
- spoid (멸균 P를 사용하여 두 번째 레이어에서 아일 레츠 선택lastic 스포이트). 감기 버퍼의 50 ML 원뿔 포함 ~ 25 ML 모든 컬렉션을 전송합니다.
- 세척 버퍼 (12-15 단계를 반복)와, 상기 3 번 씻으십시오.
- 에 Resuspend 아일 레츠 20 ML RPMI - 1640 (10 % FCS와 페니실린과 스트렙토 마이신, HEPES, 멤 - NEAA를 포함)와 부드럽게 섞는다. 계산에 대한 예제 100 UL을 제거합니다.
- 미디어 1 ML의 dithizone 1 ML을 포함 35mm 그리드 - 판 100 UL을 전송합니다.
- 미디어 / 판 30 ML의 총 160mm 접시에서 37 ° C, 7퍼센트 CO 2 배양기에서 RPMI 1640에 남아 아일 레츠를 품어.
