을 평가하기 위해 생체내에 효과, 치료 방법은 근육의 힘 생성 및 fatigability을 quantitate 필요합니다. 우리는 세부 explanted 마우스 hindlimb 근육의 묘 - 기계적 성질을 평가하는 방법을. 이 분석은 유전자 근육 기능에 수정뿐만 아니라 근육 질환의 마우스 모델 요법의 비교의 효과를 quantitating하는 강력한 방법을 제공합니다.
이 논문에서
요약
초록
근육 질환 1,2,3의 치료를위한 치료 개입의 생체내 효과에 평가하기 위해 양적 방법이 필요합니다 그 치료 근육의 힘 생성 및 fatigability 측정. 우리는 마우스에서 신선한 explanted hindlimb 근육의 묘 - 기계적 성질을 평가하기위한 상세한 방법을 설명합니다. 를 사용하고, 최대한의 트위치와 파상풍의 긴장, 수축 시간 및 반 휴식 시간의 측정, 우리는 근육 스트립 myograph (덴마크어 묘 기술 모델 820MS)의 근육을 장착, 마우스 신근 digitorum의 longus 근육의 atraumatic 수확을 설명 사각형 펄스 자극기 (모델 S48, 그라스 기술). 이러한 측정을 사용하여, 우리는 근육 단면적, 트위치 - - 파상풍에 장력 비율 힘을 주파수 관계 곡선과 낮은 주파수 피로 곡선 4 정규화 특정 트위치 및 파상풍 긴장의 계산을 보여줍니다. 이 분석은 치료 근육 질환 1,2,3,5의 마우스 모델에서 중재뿐만 아니라, 근육의 기능 6,7,8,9에 유전자 조작의 효과 비교 사이의 양적 비교하는 방법을 제공합니다.
프로토콜
프로토콜은 UCSF 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 수행합니다.
1. 마우스 신근 Digitorum의 Longus (편집 판단리스트) 근육의 해부
- 기관 지침에 따라 모든 동물 절차를 수행합니다.
- 근육 수확 10 ~ 직전 200 MG / kg intraperitoneal 자궁 / pentobarbital 전위와 동물을 안락사. 절개가 잘 근육이 안락사 15 분 이내에 수확하고 긴장 변환기에 장착할 수 있도록 연습해야합니다.
- 절개 트레이와 트레이에 핀 다리에서 지육 부정사를 마련.
- 발목의 해부 현미경, 오픈 피부 조심스럽게 열고 근막 (Fig.1A), 그리고 껍질 정강뼈에서 편집 판단리스트 (Fig.1B)를 노출하는 이상. 근육은 습한 및 수확 기간 동안 버퍼링 유지 lactated 링어의 솔루션의 방울을 사용합니다.
- 각 끝에 가능한 한 많은 힘줄로 보존, 편집 판단리스트를 제거하고, lactated 링어의 솔루션을 포함하고있는 페트리 접시에 넣어. 근육 힘줄 (Fig.1C)의 각 치료를 묶어. 이것은 근육 섬유가 다친다거나 절개하는 동안 방해하지 않는 것이 중요합니다.
2. 근육 스트립 Myograph에서 마우스 편집 판단리스트의 마운팅
- 이러한 연구는 조직 목욕은 그것이 지속적으로 산소와 일정한 온도에서 생리적 용액에 입욕 수있는 동안 그 근육을 보호해 필요합니다. 목욕은 근육의 긴장의 측정을위한 강제 변환기와 결합합니다. 우리는이 목적을 위해 덴마크어 묘 기술 (DMT 모델 820MS)에서 통합 근육 스트립 myograph 목욕을 사용합니다. 또한, 사각형 펄스 전기 자극기 (그라스 모델 S48) 및 데이터 수집 플랫폼 (ADInstruments PowerLab 데이터 수집 시스템 및 LabChart 소프트웨어) 각각 묘 - 기계적 반응을 기록 및 분석, 이끌어내는 필요합니다. DMT의 820MS는 근육 스트립의 중간 부분에 근육의 양쪽에 위치하고있는 챔버 커버 통합된 백금 전극을하고 있습니다. 기타 myographs는 전극 배치에 특정 관심을 요구할 수 있습니다.
- 5 ML 크렙스 Henseleit 솔루션 11 myograph 욕조를 채우십시오. 25 ° C.에 따뜻한 사용하기 전에 15 분 동안 목욕을 통해 버블 O 2 / CO 2 (95 % / 5 %).
- myograph의 클램프 사이의 편집 판단리스트를 확장하고 클램프 사이의 편집 판단리스트 근육의 힘줄 (Fig.1D, E)를 확보하기 봉합을 사용합니다. 근육 자체를 클램프하지 않도록주의하십시오.
- 25 myograph 목욕을 유지 ° C.
3. 묘 - 기계 분석
A.의 트위치 장력
- 어떤 근육 해이함 없다는 것을 그래서 목욕탕에 초기 길이를 설정합니다.
- , 최대한 트위치 장력을 얻기 위해서는 전압을 조정하여 최대한의 자극 (기간 0.5 MS)를 결정 후 최대한 위에 20% (supramaximal 자극을 달성하기 위해)에서 자극을 설정합니다. 우리의 연구에서는 supramaximal 자극은 일반적으로 40 볼트의 출력에서 얻을 수 있습니다.
- 오실로 스코프를 사용하여 자극기의 출력을 확인합니다.
- 트위치 장력에 더 이상의 증가가 없을 때까지 점차 근육을 스트레칭하여 최적의 길이를 결정합니다.
- 근육 3 분 평형 수 있습니다.
- supramaximal 광장 그라스 S44 전자 자극기를 사용하여 최적의 길이에서 자극 (0.5 MS) 및 레코드 출력을 제공합니다.
- 기록 : 트위치 장력 곡선 (P T VS 시간, Fig.2A).
B. 파상풍 긴장
- 근육 3 분 동안 휴식을 허용합니다.
- 그라스 S44 전자 자극기를 사용하여 최적의 길이는 150 Hz에서에서 300msec에 대한 supramaximal 자극의 기차, 레코드 출력을 적용합니다.
- 기록 : 파상풍 장력 곡선 (P O VS 시간, Fig.2B).
C. 강제 주파수
- 근육 3 분 동안 휴식을 허용합니다.
- 강제로 주파수 : 각 자극 (Fig.3) 사이 나머지 삼분 30, 60, 100, 140, 160 Hz에서에서 supramaximal 자극의 기차를 적용합니다. 또는, 기차는 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140과 낮은 주파수에서 더 나은 해결을위한 160 Hz에서, 힘 변화가 실질적으로이 적용될 수 있습니다.
- 플롯 : 강제로 주파수의 관계 (% 최대한의 힘 대 자극 주파수).
D. 피로
- 10 분 300 MS (또는 최대 무력의 50 %를 생산 조정 주파수), 매 3 초 동안 60 Hz에서 : 짧은 tetani의 기차를 적용합니다. 10 분, 파상풍의 힘은 초기 값 (Fig.4)의 ~ 15 %의 고원 수준으로 감소한다.
- 플롯 : 저주파 피로 (% 최대한의 힘 대 시간).
프로토콜의 끝에 E. 추가 데이터 수집
- myograph에서 근육을 마운트 해제하기 전에 musc 설정레 최적의 길이 III.A.4 단계에서 결정하고 현미경이나 캘리퍼스와 중 안구를 사용하여 직경을 측정 등. 단면적 (μm의 2)을 계산.
- 봉합을 제거하고 근육 무게의 근육 질량 (MG) 측정.
- 신체 질량 (GM)를 평가하기 위해 마우스의 무게를.
4. 계산
- 근육 : 신체 질량 비율 =
근육 질량 / 몸 질량 - 트위치 장력, P T (MN) =
트위치 동안 생성된 최대 장력 - 특정 트위치 장력 (N / cm 2) =
트위치 장력 (MN) / 단면적 (μm의 2) X 10 5 N / MN • μm의 2 / cm 2 - 최대 장력 시간 (MS) =
최대 긴장으로 수축의 발병에서 시간 - 하프 휴식 시간 (MS) =
최대 장력에서 최대 장력의 50 % 시간 - 파상풍의 장력, P O (MN) =
파상풍 동안 생성된 최대 장력 - 특정 파상풍의 장력 (N / cm 2) =
파상풍의 장력 (MN) / 단면적 (μm의 2) X 10 5 N / MN • μm의 2 / cm 2 - 파상풍의 상승을 최대한 속도 (N / S) =
파상풍, 즉, 파상풍 텐션 곡선 (또는, DP O / DT)의 최대 경사의 장력 상승하는 동안 긴장 증가의 최대 속도 - 하프 휴식 파상풍의 장력 (MS) =
자극을 정지에서 자극의 종료에있는 긴장의 50 % 시간 - 트위치 긴장 - 투 - 파상풍의 장력 비율, P t / P O =
최대 트위치 장력 / 최대 파상풍 장력 - 피로 지수 =
최대한의 사시도 긴장하는 저주파 피로 두 분 동안 긴장의 비율
5. 대표 결과
그림 1. 편집 판단리스트 근육의 해부. hindlimb muscles.TA, 정강뼈 앞쪽에. B, 편집 판단리스트 (신근 digitorum의 longus) 근육의 노출, 노출. C, 편집 판단리스트 힘줄을 봉합의 첨부 파일. D, 장력 변환기 욕조 (측면에서 볼.) E는 편집 판단리스트는 욕조에 마운트 (위보기에서). 의 근육은 불완전하게 설명의 목적을 위해 버퍼에 포장되어, 연습, 근육이 완전히 건조 방지하기 위해 열중한다.
그림 2. 장력 곡선의 예. 최대한 트위치 장력 (P t), 수축 시간 (CT)과 반 휴식 시간 (HRT)을 설명하는 트위치 장력 곡선의, 예. 바, 1S. B, 최대한 파상풍의 긴장을 보여주는 파상풍의 장력 곡선 (P O)의 예과 하프 휴식 파상풍의 장력 (HRTT). 바, 1S.
그림 3. 강제로 주파수 관계 분석의 예. 증분 자극 주파수에 의해 생성, 긴장. B, 30MHz에서 펄스 트레인의 예. 바, 80ms. C, 140MHz에서 펄스 트레인의 예. 바, 80ms. D, A에 표시된 데이터에서 파생된 강제로 주파수 곡선의 예. 강제로 주파수 곡선의 형태는 근육 강도의 특징이며, 다른 동물의 근육 사이에 비교할 수 있습니다.
그림 4. 저주파 피로 분석의 예. 지정된 시간 지점 (B, C, D)에서 펄스 트레인의 낮은 주파수 stimulation.Examples 기간 동안 생성, Decremental 긴장은. 아래와 같이 E, A에 표시된 데이터에서 파생된 저주파 피로 곡선의 예입니다. 저주파 피로 곡선의 형태는 근육 강도의 특징이며, 다른 동물의 근육 사이에 비교할 수 있습니다.
토론
우리는 마우스 explanted hindlimb 근육의 묘 - 기계적 성질을 평가하기위한 상세한 방법을 설명합니다. 편집 판단리스트는 때문에 정강뼈 앞쪽에 근육 뒤쪽의 사후 위치의 해부하다 더 어려운 반면, 그 유명한 건의 첨부 파일 때문에 발목과 무릎 관절에 정강뼈 앞쪽이보다 평가하기가 쉽습니다. 이 인대는 근육 스트립 myograph에 장착 용이. 대조적으로,보다 쉽게 액세스할 정강뼈 앞쪽에은 예외적으로 어려운이 모두 근육을 손상시키지 않고 절개하다, 그리고 myograph에서 안전하게 탑재하고, 무릎 관절에서 광범위한 거의 atendinous 첨부 파일을했다. 우리는 또한 빠른 속도로 생리 버퍼와 온도의 산소 욕조에있는 근육을 장착하면 근육의 기계적 성질을 유지하기 위해 필수적이라는 지적. 우리는 이러한 조건 하에서 근육 응답에 상당한 변화없이 30 분이 분석을 반복할 수 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 이것이 근육 기능에 악영향을 가지고 있고, 묘 - 기계의 힘을 싼 견적이 발생할 수있는 근육 섬유의 해부 및 장착 절차 동안 접촉하지 않는 것이 중요합니다. 다음 절차에 따라,이 분석은 근육 기능 6,7,8,9에 유전자 조작의 효과뿐만 아니라 근육 질환 1,2,3,5의 마우스 모델에서 치료 중재 사이의 비교 평가하기 위해 강력한 양적 접근 방식을 제공합니다 .
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NHLBI에서 PEO에 대한 보건 서비스 그랜트 (HL086513) 및 재생 의료 (RC1 - 00104), NHLBI에서 보건 서비스 그랜트 (HL085377)의 캘리포니아 연구소에서 종합적인 연구 그랜트에 의해 지원하고 있던 선물 Pollin 재단 HSB로
SC는 샌프란 시스코 주립 대학에 세포 연구 수상 (TB1 - 01194) 줄기로 재생 의학의 교량에 대해 캘리포니아 공과 대학에 의해 지원되었다.
재료
솔루션 및 미디어
Lactated 링어의 솔루션
- 100 MM NaCl
- 30 MM CH3CH (OH) 쿠나 (락트 산 나트륨)
- 4 MM KCl
- 1 ㎜ CaCl 2 2 시간이 O (염화칼슘 이수화물)
- 6.75로 산도를 조절
크렙스 Henseleit 솔루션
- 118 MM NaCl
- 4.7 MM KCl
- 1.25 MM CaCl 2
- 1.2 MM MgCl 2
- 1.2 MM KH 2 PO 4
- 25 MM NaHCO 3
- 11 MM 포도당
- O 2 / CO 2 (95 % / 5 %) 가스 equilibrating하여 7.2-7.4로 산도를 조절
Pentobarbital
- 멸균 물 5 MG / ML 작업 솔루션
참고문헌
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재인쇄 및 허가
