이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 쥐 네크로 텍스의 피라미드 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널의 표현과 기능적 역할을 공부했습니다. 때문에이 채널에 대한 특정 약리 대리인의 부족, 우리는 채널 표현을 조작하는 유전자 접근 방식을 촬영했습니다. 우리는 세포 형태학 및 피질의 판상 패턴을 유지하기 위해 organotypic 문화 준비 (16)를 사용합니다. 우리는 일반적으로 출생 후의 일 8-10에서 급성 neocortical 조각을 분리하고 3~7일에 대한 문화의 슬라이스를 유지합니다. 이것은 우리가 급성 슬라이스와 함께 우리의 일을 사람들에게 비슷한 나이에 신경을 공부 수 있으며 통에 풍부한 흥분성의 연결의 개발을 최소화합니다. 우리는 전류 또는 전압 클램프의 전체 세포 패치 클램프와 함께 적외선 조명 (IR -)와 차동 간섭 대비 현미경 (DIC)를 사용하여 레이어 II / III 또는 V에서 시각 식별 피라미드 뉴런에서 기록합니다. 우리는 그들의 기능을 연구하기 위해 채널의 표현을 조작하는 야생 형식이나 돌연변이 칼륨 채널의 DNA biolistic (진 총) transfection을 사용합니다. transfected 세포는 쉽게 녹색 형광 단백질 (GFP)의 cDNA와 함께 공동 transfection 후 epifluorescence 현미경으로 식별됩니다. 우리는 동일한 슬라이스에서 동일한 레이어에 인접해 untransfected 뉴런에 transfected 세포의 음반을 비교합니다.
프로토콜
1. 칼자국의 하루 전에 준비
우리는 수술 악기 압력솥 사전 깔끔히의 하루 솔루션을 준비하는보다 효율적입니다 찾습니다.
- 압력솥 악기. (수술과 깔끔히가 반 무균 조건 하에서 수행됩니다.) 개별적 압력솥 종이에 싼 다음과 같은 패키지를 압력솥 :
- 수술 패키지 주걱, # 22 메스 블레이드 핸들, 가위, 집게
- 깔끔히 패키지 : 3 단자 (블레이드 잡고 손잡이와 2 개의 목욕탕 - 확보 단자) 및 블레이드 경비 (기계에서 면도날 보유 : 캠덴 Vibroslice # MA572)를 (가 냉동실에 넣어되기 때문에), 개별적으로 포장 습관 (금속 챔버했다 슬라 이서 (하나는 반복 autoclaving을 견딜 수 없을 것이다 제조 업체의 플렉시 글라스), hemostat, 가위, 집게에 대한 표본 목욕).
- 유리 패키지 두 개의 50 ML 비커 한 25 ML의 비커
- 나누어지는 말 혈청 (Hyclone 기증자 에콰인 # SH 30074 : Thermoscientic). 나누어지는 ~ 15 ML 원뿔 튜브에 말 혈청 11 ML. (10mL....
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토론
우리는 쥐를 네크로 텍스 (4, 9-11)에서 피라미드 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널의 표현과 기능적 역할을 공부했습니다. 때문에이 채널에 대한 특정 약리 대리인의 부족, 우리는 채널 표현 (1,14,15,17-19)를 조작을위한 유전자 접근 방법을 사용합니다. 세포 형태학 및 피질의 판상 패턴을 유지하기 위해 Stoppini 외 (16)의 접근에서 수정. 우리는 organotypic 문화 준비 (12,13,15-22,, 5-8 2,3) 활용. 우리는 6-17 출생 후의 일에서 급성 neocortical 조각을 분리하고 2~7일에 대한 문화의 슬라이스를 유지합니다. 이것은 우리가 급성 조각과 함께 작품에 비슷한 세 뉴런을 연구 수 있으며 통에 풍부한 흥분성의 연결의 개발을 최소화합니다. 우리는 적외선 조명 (IR -)과 전류 또는 전압 클램프의 전체 세포 패치 클램프 차등 간섭 대비 현미경 (DIC)를 사용하여 레이어 II / III 또는 V에서 시각 식별 피라미드 뉴런에서 기록합니다. 야생 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 뛰어난 기술 지원을 마유미 Sakuraba과 레베카 Foehring 감사하고 싶습니다. 또한, 우리는 DRS 감사하고 싶습니다. transfection에 대한 cDNA 구성으로 우리를 제공할 organotypic 슬라이스 문화와 biolistic transfection 프로토콜 및 박사 진 Nerbonne 구현에 도움을 로드리고 안드레 이드. NINDS (RCF)를에서 NS044163 :이 작품은 NIH 교부금에 의해 지원되었다.
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재료
외과 / transfection / 문화 :
- 브레인 슬라 이서 : 캠덴 Vibroslice # MA572 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 미국
- 진 건 시스템 : 바이오 래드는 # 165-2431을 (바이오 - 래드 연구소, 1000 알프레드 노벨 드라이브, 헤라클레스, CA 94547) 편
- 진 총, 레귤레이터, 튜브 준비 스테이션 (# 165-2418), 주사기 키트, Tefzel 관, 튜브 커터, 최적화 키트 (# 165-2424), 튜브 커터와 헬륨 호스 어셈블리를 : 포함
- 바이오 래드 헬륨 조정기 (# 165-2413)
- 에 대한 일회용 용품 바이오 래드에서 헬리 우스 :
- 1.6 μm의 골드 Microcarriers : # 165-2264
- Tefzel 관 : # 165-2441
- 인큐베이터 : 견적 과학적 모델 # 3110 (온습 과학 (866) 984-3766).
미디어 :
- 호스 세럼 : Hyclone 기증자 에콰인 # SH 30074. (HyClone, 925 웨스트 1800 사우스, 로건, UT 84321)
- HMEM (최소 필수 미디어 플러스 HBSS와 HEPES, 아니 글루타민 : Lonza BioWhittaker 카탈로그 # 12 - 137F) : GIBCO / INVITROGEN (800) 955-6288, 옵션 1.
- HBSS (GIBCO 행크스가 # 24020-117를 호수 버퍼) : GIBCO / INVITROGEN (800) 955-6288, 옵션 1.
- 멤 (GIBCO 최소한의 필수적인 매체, # 12360-038), GIBCO / INVITROGEN (800) 955-6288, 옵션 1.
- 250 ML Millipore 0.2 μm의 필터 : # SC6PU02RE
- 플라스틱 전송 pipettes : 피셔 # 13-711-20.
- 50 ML Millipore steriflip 0.22 μm의 필터 (# SCGP00525)
피셔 과학, 1,241 대사 블러 바드, PO 상자 14989, 세인트 루이스, MO 63132 : 얻은 항목 6-8.
녹음 :
- Pipet 유리 : 하버드 GC150TF - 10 : 하버드 장치, 84 옥토버 힐로드, 홀리스튼, 매사 추세츠 01,746
- 서터 P - 87 수평 전극 풀러 : 서터 악기 회사, 하나 디지털 드라이브, 노바토, CA 94949
- 액슨 인스 트루먼 트의 Multiclamp 700B 앰프 : 분자 디바이스 주식 회사 1311 뉴올리언스 드라이브, 서니 베일, CA 94089-1136
- 분자 디바이스, 주식 회사, 1311 올리언즈 드라이브, 서니 베일, CA 94089-1136 : 10 데이터 수집 소프트웨어를 PClamp
- 서터 악기 회사, 하나 디지털 드라이브, 노바토, CA 94949 : lectrode 위치는 셔터 교전 - 200 manipulators와 PC - 200 컨트롤러와 제어됩니다.
- 현미경 : IR - DIC 광학과 올림푸스 BX - 50WI 똑바로 현미경
- IR - 민감한 카메라 OLY - 150 (올림푸스) 또는 DAGE - MTI (DAGE - MTI, 46360 IN 01 노스 Roeske 애비뉴, 미시건 시티).
참고문헌
- Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
- Buonomano, D. V.
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