우리는기도를 통해 anesthetized 생쥐의 폐에 시험 물질의 비 수술 전달을 보여줍니다. 이 방법은 세균과 바이러스 병원균, 크린 시토킨, 항체, 구슬, 화학, 또는 염료로 폐 노출 수 있습니다. 우리는 더 이상 수확 및 유동세포계측법에 대한 폐, 폐 배수 림프절 (LDLNs) 처리 설명합니다.
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방법 논문
유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림
이 논문에서
요약
초록
이러한 폐포 macrophages 및 폐 돌기 세포 (LDCs)로 Phagocytic 세포가 지속적으로 폐에서 폐포 공간에서 항원을 샘플. LDCs는 특히 폐 배수 림프절 (LDLNs)들이 immunogens 1,2의 다양한 적절한 면역 반응을 시작 T 세포 흡입 항원을 제시 어디에.로 마이 그 레이션하는 것으로 알려져 있습니다 생쥐의 폐, 공기 항원 사이의 상호 작용 모델하려면, 항원은 intratracheally 5 에어로졸 6 등 intranasally 1,3,4 관리하실 수 있습니다. 각 경로로 배달 고유 기술 기술과 실험을 설계하기 전에 고려해야 할 제한 사항을 포함한다. 예를 들어, 비강 및 aerosolized 노출은 폐와 상부 호흡기의 넓이 모두에 항원을 제공합니다. 따라서 항원 가능성이 결과의 해석을 복잡, 비강 관련 림프 조직 (NALT) 7에 액세스할 수 있습니다. 또한, 삼키는, 재채기와 마우스의 호흡 속도는 전달 복용에 불일치가 발생할 수 있습니다. 상부 호흡 트랙트의 참여가 어떤 연구를 위해 선호하는 수 있지만, 그것은 특히 폐에서 시작된 이벤트에 초점을 실험을 복잡하게하실 수 있습니다. 그것은 폐에에 직접 테스트 자료를 제공하고 NALT를 무시으로이 설정에서, intratracheal (IT) 경로가 바람직합니다. 많은 그것 주입 프로토콜은 구강이나 폐에에 액세스할 수있는 기관의 수술 노출을 통해 기관 중 시각 삽관법를 포함. 여기에, 우리는 기지에 대한 간단한, 일관성, 비 수술 방법을 설명합니다. 기관의 개통은 후두경를 사용하여 시각이며 구부러진 gavage 바늘은 다음 innoculum를 제공하는 기관에 직접 삽입됩니다. 우리는 또한 수확 및 유동세포계측법에 의해 항원 인신 매매의 분석 LDLNs 및 폐의 처리를위한 절차를 설명합니다.
프로토콜
1. 과정을하기 전에 준비를 다음과 같은 항목을 수집
- 절차를 수행하는 동안 마우스를 묶을 수있는 목조 플랫폼 구축을위한) 그림 1A에있는 이미지 참조) 및 1B하시기 바랍니다.
- HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypeIV 또는 2.5 MG / ML Collagenase D - 림프절에 대한 소화 믹스
- 폐에 대한 소화 믹스 - HBSS가 + 1 MG / ML Collagenase
- LDLNs을 시각화하기 위해 intraperitoneal 주사 PBS에서 라텍스 구슬 (1시 20분)를 희석
참고 : LDLNs 찾아 작은 열심히하고 있습니다. 그들을 찾는 방법에 대한 자세한 내용은 마우스로 빨간색 형광 라텍스 구슬이 IP 희석 1시 20분의 200μl 주입. 복막이 LDLNs 8 빼낸. 24 hpi은 위에 설명된대로 마우스의 흉강을 폭로. LDLNs은 복막 캐비티에서 탈진 비즈에서 분홍색 표시됩니다.
- 적혈구 세포 (RBC) 용해 완충액 - 0.15M NH 4 Club 호텔, 10mM KHCO 3, 1L DH
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토론
우리는 폐에서 LDLNs에 바실러스 anthracis 포자의 인신 매매를 공부하기 위해이 프로토콜을 이용합니다. 유사한 어플 리케이션의 경우, 폐에 전달 입자의 개수는 신중하게 주입 자료가 유동세포계측법하여 LDLNs에서 검색된 수 있도록 선택하여야한다. 우리는 또한 성공적으로 세포 찬란 표시된 항체를 사용하여 특정 폐 세포 집단의 라벨링의 입양 전송을 위해이 방법을 사용했습니다. 또한,이 방법은 정기적으로 직접 폐로 10에 bleomycin (폐 섬유증의 화학적 유도)과 크린 시토킨를 관리하는 데 사용됩니다.
이 방법은 폐에에 테스트 자료의 일관성있는 전달을 허용하지만, 광범위한 교육 및 검증 (폐에 염료를 instilling하여 달성)이 필요합니다. 중요한 상호 작용과 면역 반응이 시작 될 수있는 상부 호흡기를 제외하기 때문에이 방법은 흡입의 다른 노선과 같은 생리 관련이 없을 수 있습니다. 그러나 해석은 머리와 목 지역 림프절로와 호흡.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| 70μm 셀 stariner | BD | ||
| 아닐린 블루 | 어부 | A967 - 25 | |
| 동물 먹이 바늘 | 포퍼 앤드 손즈 병원 | 7920 | |
| Collagenase | 시그마 | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | 워싱턴 | ||
| Collagenase D | 로체 | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14,190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc의 | 17,152 | |
| 염화칼슘과 마그네슘 염화물없이 HBSS | Invitrogen | 14,170 | |
| 케타민을 HCL (100mg/ml) | Hospira 부동산 | ||
| 후두경 블레이드 | PennCentury, Inc의 | 모델 LS - 1 | 을 참조하십시오 www.penncentury.com |
| 경량 광섬유 후두경 | WelchAllyn | 80,814 | |
| 레드 형광 비즈 (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | IP 주사 |
| Xylazine (100mg/ml) | 로이드 레버 토리스 |
참고문헌
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Imm....
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