siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

요약

endoplasmic reticulum은 단백질 biogenesis과 칼슘 항상성에 중요한 역할을합니다. 우리는 우리 Ca2 + 누출 채널의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘을 특징 수있는 실험적인 체제를 구축했습니다. 이 시스템은 siRNA 중재 유전자 입을 라이브 세포 Ca2 + 이미징을 포함한다.

초록

포유 동물 세포에서, endoplasmic reticulum (ER)은 단백질 biogenesis뿐만 아니라 칼슘 ^{1 신호에서} 핵심적인 역할을 담당하고 있습니다. ER 막의 heterotrimeric Sec61 단지는 응급실의 루멘에 새로 합성된 polypeptides에 대한 수성 경로를 제공합니다. 다양한 연구소에서 최근 작업이 heterotrimeric 복잡한 또한 일시적인 칼슘 ^{2 +} 누설 채널 ^2-8을 형성 수도 것을 제안했습니다. 이 개념에 대한 핵심 관찰 puromycin가 ⁺ 응급실에서 칼슘 ² 과도 릴리스로 연결하여 ribosome과 Sec61 복잡한에서 초기 polypeptides의 릴리스되었습니다. 또한, 그것은 응급실 luminal 단백질 bip (빨리)이 Sec61 복잡한 ^9,10 수준에서 이온 투과성 방지에 관여 것을 체외에서 관찰했다. 우리는 바로 잠재적인 칼슘 ^{2 +} 누설 채널로 Sec61 단지의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘 ^11-13 특성을 수있는 실험적인 체제를 구축했습니다. 이 시스템은 siRNA의 중재 유전자 입을 라이브 세포 칼슘 ^{2 +} 영상 ¹³ 결합되어 있습니다. 세포는 코딩 및 번역되지 않은 지역 (UTR), 각각 SEC61A1 유전자이나 부정적인 제어 siRNA에 대한 이동합니다 siRNAs로 취급됩니다. complementation 분석에서 세포는 wildtype SEC61A1 유전자의 siRNA 방지 표현이 가능 IRES - GFP 벡터와 공동 transfected 있습니다. 그러면 세포는 cytosolic 칼슘 ² 동시에 변경 ⁺ 형광 현미경을 통해 세포의 여러 농도를 모니터링하기 위해 ratiometric 칼슘 ^{2 +} - 표시기 FURA - 2와 함께로드됩니다. cytosolic 칼슘 ² 연속 측정 ^+도 허용 칼슘 ^{2 +} 누설에 같은 puromycin, 작은 분자 억제제 및 thapsigargin 등 다양한 대리인의 영향의 평가. 이 실험 시스템이 수동 칼슘 ^{2 +} 유출을 제한 단백질과 구조를 특징 짓는 여러 가지 세포 유형 II의 응급실에서 수동 칼슘 ^{2 +} 유출 다른 ER 막 단백질의 기여를) 평가) 나는 우리에게 독특한 기회를 제공하고, 3) 관련 부품에 연결된 질병 돌연변이의 효과를 연구.

프로토콜

1. 재고 솔루션의 준비

1. 준비 칼슘을 무료로 버퍼 (140 MM NaCl, 5 KCl MM, 1 MM MgCl _2, 0.5 MM EGTA, 10 HEPES MM - 코 10 MM 포도당 (산도 7.35)).
2. Solubilize FURA - 2 1 ㎜ 주식 솔루션을 얻기 위해 DMSO에 오전. 솔루션 homogenously 밝은 노란색까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. 빛과 컵을 보호. 희석 FURA - 2 주식 솔루션 1 ML Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)는 헬라 세포의 로딩 4 μm의의 최종 농도 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는으로 AM.
3. 증류수 (산도 7.0)에서 12.5 MM의 puromycin 주식 솔루션을 준비합니다. -20 ° C.에 저장 aliquots 500 μm의 제품 puromycin의 최종 농도에 칼슘 무료로 버퍼에 12.5 MM의 puromycin 주식 솔루션을 희석.
4. 1 MM 주식 솔루션을 얻기 위해 DMSO에 thapsigargin을 디졸브.
5. 1 MG ophiobolin 20 μl 클로로포름에 A와이 이후, 25 μl DMSO와 혼합 Solubilize. 클로로포름이 증발 때까지 microcentrifuge 관이 열려 있습니다. 따라서 최종 ophiobolin는 농도 100 MM입니다. -20 ° C.에 저장 aliquots 이전 100 μm의의 최종 농도 칼슘 무료 버퍼로 주식 솔루션을 희석, 사용할 수 있습니다. 따라서, 라이브 셀 이미징에 대한 최종 DMSO의 농도는 0.1 %를 초과하지 않습니다.
6. -20 ° C. 10 MM 및 매장 aliquots의 농도로 DMSO에 trifluoperazine을 풀다 사용하기 전에 10 μm의의 최종 농도 칼슘 무료 버퍼로 주식 솔루션을 희석. 라이브 셀 이미징에 대한 그러므로 최종 DMSO 농도는 ophiobolin 위해 같은 0.1 %를 초과하지 않습니다.
7. 20 μm의 주식 솔루션을 준비하는 RNase 무료로 물속에 siRNAs을 (SEC61A1 siRNA, SEC61A1 - UTR의 siRNA 및 제어 siRNA) 디졸브. 소용돌이를 사용하여 혼합하고 눈으로 solubilization을 관찰. -20 ° C.에 상점 50 μl aliquots

2. 헬라 세포의 유전자 입을

ER 칼슘 ^{2 +} 유출하는 특정 단백질의 공헌을 연구하기 위해, 각각의 유전자가 효과적으로 두 개의 다른 siRNAs (그림 1)과 함께 입을 수 있습니다. 또한, 입을의 효과는 해당 야생 유형 유전자의 표현에 의해 극복되어야한다. 일반적으로 우리가 관심있는 유전자의 각각 코딩 및 비 - 코딩 (UTR) 지역,에 대한 이동합니다 siRNAs을 사용합니다. UTR - 감독의 siRNA를 채용하는 것은 complementation위한 편리한 방법을 제공합니다.

1. 시드 5.2 25mm 커버 슬립 (1 H에 대한 폴리 - L - 라이신 (1 MG / ML) 200 μl와 함께 예약 처리)와 6cm ​​문화 접시에있는 X 10 ⁵ 헬라 세포 (ATCC 안돼. CCL - 2) Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)는 5 % CO ₂ (최종 볼륨 3.9 ML)로 humidified 환경에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 37 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 부화는 ° C를 포함 인치
2. SEC61A1 siRNA, SEC61A1 - UTR의 siRNA 또는 제조 업체의 지침 (20 NM siRNA의 최종 농도)에 따라 HiPerFect 시약을 사용하여 부정적인 제어 siRNA와 세포 Transfect. 간단히, 전에 실제 transfection 절차에 별도의 microcentrifuge 관에서 갓 siRNAs 준비 : OptiMEM 80 μl에 녹아있는 각 siRNA 4 μl (20 μm의) 20 μl HiPerFect transfection 시약을 추가합니다. 이 혼합은 부드럽게 vortexed 10 분 실온에서 incubated입니다. 씨앗 5.2 X 10 ⁵ 헬라 세포 (3.9 ML)에 dropwise siRNA 믹스를 (104 μl) 추가합니다.
3. 24 H 후, 매체를 변경 (3.9 ML)과 같은 siRNA 믹스 (104 μl)와 두 번째 시간 동안 세포를 transfect.
4. 서양 얼룩 분석하여 입을을 평가해보십시오. 그것이 80 % 이상이어야합니다. 의 세포 배양 접시에서 세포를 씻어 염분 (PBS)는 인산염 버퍼와 DMEM에서 그들을 수확. 카운테스 자동 셀 카운터를 채용하여 전지를 계산합니다. 단백 분해 효소 - 억제제 칵테일 (3 μg / ML의 Pepstatin 3 μg /과 보충 (10 MM NaCl, 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 3 MM MgCl _2, 0,5 % NP40) 세포 용해 완충액으로 세포를 Lyse ML 류펩틴, 3 μg / ML Antipain 3 μg / ML의 Chymastatin)와 SDS - 샘플 버퍼 (함께 혼합 60 MM 트리스 - HCL, pH를 6.8, 2% SDS, 10 % 글리세롤, 5 % β - 메르 캅 토 에탄올, 0.01 % 블루 bromphenol ) 10.000 셀 / μl의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. 열 샘플 56 ° 15 분 C하고, 이후, 단편 DNA 일부 글라스 비즈 20 분 와동를 추가합니다. Laemmli 유형 SDS - PAGE (일반적으로 분리 젤에 대한 polyacrylamid 15 %) 각 샘플 별도의 20 μl. 전송 버퍼에서 3 H 또는 야간 (100 MM Glycin, 12.5 MM 트리스 - HCL)에 대한 지속적인 400mA에서 ( "젖어 얼룩") electroblotting하여 PVDF 막에 분리된 단백질을 전송합니다. 이후 다음 5 % (W / V) 실온에서 30 분 PBS에 저지방 탈지 우유와 함께 블록은 토끼에서 Sec61α의 C - 말단에 대한 감독 차 항체에 얼룩을 폭로하고 반대 β - 굴지 - 마우스 항체. PBS - TritonX - 100에 얼룩 (0.05 %)를 씻고 t각각 5 분 PBS에 와이스. ECL 플렉스 염소 - 안티 토끼를 사용하여 기본 항체를 떠올 IgG - Cy5 또는 ECL 플렉스 염소 - 안티 - 마우스 IgG - Cy3 - 공액 및 이미지 퀀트 TL 소프트웨어 7.0와 함께 태풍 - 트리오 이미징 시스템입니다. SEC61A1 유전자의 경우, 최대 입을 효과는 일반적으로 첫 번째 transfection 후 96 H를 볼 수 있습니다. 대표 실험은 그림에 표시됩니다. 2.

3. 헬라 세포의 Complementation

SEC61A1 입을의 표현형를 구출하기 위해 SEC61A1 cDNA는 pCDNA3 - 내부 ribosomal 항목 사이트의 여러 복제 사이트 (MCS) (IRES) - GFP - 벡터 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 발기인, MCS를 포함에 삽입되었다 IRES, 플러스 녹색 fluoresecent 단백질 (GFP) 코딩 순서.

1. 최초의 siRNA의 transfection 후 48 H, 교환 두 번째 시간 매체 (3.9 ML)과 제조 업체의 프로토콜 (Fugene HD 벡터의 최종 비율 4 μg에 따라 Fugene HD를 사용하여 빈 벡터 또는 플라스미드 SEC61A1 표현 중 하나와 함께 세포 변환 16 μl Fugene HD 벡터). 간단히 사전 변환 절차를 별도 microcentrifuge 관에서 갓 plasmids 준비 : OptiMEM 80 μl에 녹아있는 것을 각 플라스미드 4 μg 16 μl Fugene HD 변환 시약을 추가합니다. 10 분 실온에서 부드럽게 와동이 믹스와 부화. 씨앗 5.2 dropwise 플라스미드 믹스 (0.1 ML) × 10 ⁵ 헬라 세포를 (3.9 ML) 추가합니다.
2. 플라스미드 표현, 칼슘 이미징 및 수확하기 전에 형광 현미경에 따라 문화 요리 48 H 후. 필요한 경우하는 것이 더 나은 형광 신호를 PBS로 DMEM를 교체하십시오. 냉각 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경에 형광 이미지를 기록합니다. 변환 효율은 브라이트 모드에서 계산 80 % 이상되어야 세포 GFP 형광을 표시하는 세포의 수를 나눔으로써 결정하실 수 있습니다. 전형 결과는 그림에 표시됩니다. 3.

4. 라이브 세포 칼슘 이미징

1. 이전 측정하기 위해 별도의 3.5 ㎝ 문화 접시에있는 헬라 transfected 세포와 코팅 커버 슬립을 전송할 수 있습니다. FURA - 2 25 ° 어둠 ^11,12에 C에서 45 분 1 ML DMEM에서 오전 4 μm의와 세포를로드합니다.
2. iMIC 금속 챔버에서 25mm 커버 슬립을 수정하고 두 번 세포를 씻어과 칼슘 무료 버퍼 (각 시간을 300 μl)에 품어.
3. 340 NM 및 380 nm의에서 번갈아 흥분에 의해 색채 V와 iMIC 현미경에 대한 데이터를 수집하고 510 nm의 (; 에미터, 70분의 605 NM beamsplitter, 565 nm의 필터 설정)에서 배출 형광 측정을 시작합니다. 매 3 S. 20-50 세포 / 프레임을 포함하는 샘플 이미지 F340과 F380은 각각, 340과 380 nm의의 배경 - 빼서 형광 강도에 해당하는 비율 F340/F380로 기록 FURA - 2 신호.
4. 1 분 후, 칼슘 무료로 버퍼에 또는 동일한 버퍼와 puromycin와 세포 (500 μm의) 취급. 또는 작은 분자 억제제 (예 : 10 μm의의 trifluoperazine 또는 100 μm의 ophibolin 등) 또는 칼슘 무료 버퍼로 세포를 처리합니다.
5. ratiometric 측정은 2 또는 10 분 실시 후, thapsigargin을 추가 (1 μm의)와 측정을 계속합니다.
6. 결국 cytoslic [칼슘 ^{2 +]} 설립 보정 방법으로 비율 측정에서 추정된다. ² 엑셀 2007 오리진 6.1으로 데이터를 분석합니다.

5. 대표 결과 :

지금까지 우리는 SEC61A1 유전자의 입을은 칼슘에 영향을 여부 질문 (CA ^{2 +)} 응급실 (그림 1)에서 누수를 해결. SEC61A1 유전자는 96시간에 대한 헬라 세포에 두 개의 서로 다른 siRNAs로 침묵했다. 거의 아무런 영향이 없으며, 세포 성장과 생존을 입을 있지만, 세미 permeabilized 세포의 응급실에 단백질 수송은 거의 완전히 저해되었다. 또한, SEC61A1 침묵 세포가 심각하게 응급실에서 칼슘 ^{2 +} 유출과 관련하여 영향을 받았다고. 유전자 입을의 효과는 SEC61A1 유전자 표현에 의해 반대되었다. 따라서, 모든 nucleated 세포의 응급실 막에 존재 Sec61 단지는 칼슘 ^{2 +} 항상성에 중요한 역할을 할 것으로 기대 수있는 칼슘 ^{2 +} 누출 채널을 형성합니다. 그러나, 같은 ER 막에 Sec61 단지로 형성 억제 이온 투과성 대형, 물이 가득한 모공의 존재, 진지하게 ⁺ ER의 루멘에서 cytosol, 세포에 필수적인 메커니즘에 칼슘 ^2의 규제 릴리스를 방해 할 꺼야 신호. 우리는 포유 동물 Sec61α의 cytosolic N - 말단에 calmodulin (CAM) 바인딩 모티브를 확인한 바운드 캠 아니라 ^칼슘이 nanomolar 친화 및 시퀀스 특이성과 ⁺ 무료 apocalmodulin. 세포 수준에서, 두 개의 서로 다른 캠 antagonists는 CA를 자극 ^{(4와 5 무화과)의 부재에있는 존재의 응급실에서 + 릴리스. Sec61 채널 Sec61α의 IQ의 모티브에 변이를 포함하는 현재했을 때 후자는 관찰되지 않았습니다. 따라서, CA 2 + - CAM은 칼슘이 제한 + 응급실 (그림 6)에서 누출에 관한 일을하고있다.}

그림 1. 플로우 차트. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오.

그림 2. 효율성을 입을위한 데이터 분석. 입을는 (로딩 제어) Sec61α 및 β - 굴지에 대한 감독했다 항체를 사용하여 서양 얼룩 분석에 의해 평가되었다. 기본 항체는 ECL 플렉스 차 항체 및 형광 이미징을 사용하여 시각되었습니다.

그림 3. transfection 효율을위한 데이터 분석. 이미지가 냉각 CCD 카메라가 장착된 형광 현미경에 기록되었다. 변환 효율은 브라이트 모드에서 계산 세포 GFP 형광을 표시하는 세포의 수를 나눔으로써 결정하실 수 있습니다.

제어 또는 SEC61A1 - siRNA와 CAM - 길항제 ophiobolin A. 헬라 세포의 존재 또는 부재의 존재에 헬라 세포의 라이브 세포 칼슘 이미징에서 그림 4. 스크린샷은 SEC61A1 (B) 또는 향한 siRNA로 치료했다 부정적인 제어 siRNA는 (A) 96에 대한 H가로 지적했다. 이러한 세포는 칼슘 표시기 FURA - 2이라서로드 및 칼슘 ² incubated되었습니다 ⁺ 버퍼에 다음 0.5 MM EGTA, 버퍼 또는 ophiobolin (Ophio)을 포함 무료로 버퍼가 추가되고 부화가 재개되었습니다. 10 분 후에, CA ^{2 +} 릴리스는 외부 칼슘 ^2의 부재에서 thapsigargin (TG)를 적용하여 시작했습니다 ^+와 부화가 계속되었다. 지속적인 칼슘 이미징에서 화면 캡처는 지정된 시간에 찍은.

그림 5. 라이브 세포 칼슘 이미징 실험을위한 데이터 분석. 로 그림에 묘사된 실험 일련의 (A) 운동 및 정량 분석. 4A. Cytoslic [칼슘 ^{2 +]} 설립 보정 방법 ² 비율 측정에서 추정되었다. thapsigargin의 효과가 막대 도표로 표시됩니다. (BD) 셀은 48 H에 대한 제어 siRNA 또는 SEC61A1 - siRNA 표시로 취급하고 제어 벡터 (C), 또는 플라스미드 SEC61A1 표현 (C), 또는 표시 플라스미드 돌연변이 SEC61A1 표현 (D) 중 하나와 함께 변형되었다. 4 5A의 오른팔에서와 같이 48 후 H는 칼슘 이미징 실험이 수행되었다. cytosolic 칼슘 ^2의 변화 통계 분석 ⁺ 등이 표시됩니다 소개하고 같이 실험에 thapsigargin의 추가 이후 농도. P 값 <0.001는 unpaired t 검사로 중요한로 정의되었다 세 별표 (***), NS, 중요하지으로 표시됩니다. 분석되었습니다 세포의 번호가 표시됩니다. 평균 값이 주어진, 오류 막대 수단 (SEM)의 표준 오류를 나타냅니다. 우리는 이러한 사례가 심판 적응다고합니다. 13.

그림 6. 이러한 데이터가 Sec61 복잡한에서 초기 체인의 출시 실제로 응급실과 Sec61 복합 cytosolic 입 주위에 칼슘 nanodomain의 형성에서 칼슘 릴리스로 연결되었음을 나타냅니다. 이 칼슘은 calmodulin에 의해 바운드 및 칼슘 calmodulin는 Sec61 복잡한을 닫습니다. "

토론

포유 동물 세포에서, endoplasmic reticulum (ER)은 단백질 biogenesis뿐만 아니라 칼슘 신호에 중요한 역할을합니다. 여기, 우리는 직접 한 잠재적인 칼슘 ^{2 +} 누설 채널의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘 ¹³ 성격 수있는 실험 시스템을 설명합니다. 이 실험 시스템이 수동 칼슘 ^{2 +} 유출을 제한 단백질과 구조를 특징 짓는 여러 가지 세포 유형 II의 응급실에서 수동 칼슘 ^{2 +} 유출 다른 ER 막 단백질의 기여를) 평가) 나는 우리에게 독특한 기회를 제공하고, 3) 관련 부품에 연결된 질병 돌연변이의 효과를 연구.

우리는 오직 가능한 세포 분석해야 유의하고 전반적인 생존은 80 % 이상되어야합니다. 따라서, 세포 생존 능력은 정기적으로 제조 업체의 프로토콜에 따라 핵 ID 녹색 / 청색 세포 생존 시약을 채용 평가됩니다. 또한, cytosolic 칼슘 ^2의 변화 통계 분석 ⁺ 농도는 필수입니다. 따라서 실험은 최소한 20 세포가 하나의 실험에서 각 조건에 대해 분석해야과 함께 세포의 네 가지 일괄적으로 두 coverslips을 위해 실시해야합니다. 우리는 다양한 실험 커버 전표에 시딩 후 동시에 실시해야합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
DMEM + GlutaMAX	Invitrogen	31,966
OptiMEM + GlutaMAX	Invitrogen	51,985
FBS	Biochrom	S0115
페니실린 / 스트렙토 마이신	PAA	P11 - 010
HiPerFect	Qiagen	301707
Fugene HD	로체 진단	04709713
원자력 - ID 블루 / 그린 세포 생존 시약	엔조 생명 과학	ENZ - 53004
FURA - 오전 2시	Invitrogen	F - 1221
Puromycin	시그마	P 7255
Thapsigargin	Invitrogen	T - 7459
Ophiobolin	엔조 생명 과학	ALX - 270-109
Trifluoperazine	시그마	T 6062
카운테스 ® 자동 셀 카운터	Invitrogen
태풍 - 트리오 이미징 시스템	GE 헬스케어
DS - 5Mc 카메라와 함께 TE2000 - S 현미경	니콘
색채 V와 iMIC 현미경	Photonics 틸