CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

Summary

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

Abstract

적혈구 조혈의 연구는 이전 조혈 및 erythroid progenitors에서 형성하는 방법 빨간색 세포 이해하는 것을 목표로하고있다. 특히, 빨간색 셀 형성 율이 그의 합성 조직 hypoxia에 의해 트리거되는 호르몬 erythropoietin (EPO)에 의해 규제됩니다. EPO의 급속한 증가에 적절한 조직 산소 결과, erythropoietic 속도 증가를 주도하는 위협 erythropoietic 스트레스 반응으로 알려진 과정. 붉은 세포를 순환의 숫자의 증가는 결과 조직 산소 전달을 향상시킵니다. 효율적인 erythropoietic 스트레스 반응 따라서 생존과 같은 높은 고도, 빈혈, 출혈, 화학 요법 또는 줄기 세포 이식과 같은 생리 학적 및 병리 학적 조건에서 회복하는 것이 중요합니다.

마우스 적혈구 조혈 및 스트레스 반응의 연구에 중요한 모델입니다. 마우스 최종 (성인 타입) 적혈구 조혈은 신생아 비장에서 성인 비장 및 골수에서 배아 일 12.5과 15.5 사이의 태아 간에서 이루어진다. 조직에 erythroid progenitors를 식별하는 방법의 클래식 EPO 함유 반 고체 미디어 도금 때 붉은 세포 식민지을 일으키다 이러한 세포의 능력에 의존하고 있습니다. 그들 erythroid 전구체의 자손은 형태학의 기준에 따라 구분됩니다. 나도 이러한 고전적인 방법을 분자 연구를위한 차별화 단계 특정 erythroid 세포의 큰 숫자에 액세스할 수 없습니다. 우리가 직접 갓 절연 마우스 조직의 맥락에서 분화 단계 특정 erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질을 식별하고 공부의 흐름 cytometric 방법을 제시한다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119에 의존하고, 흐름 cytometric '전달 - 분산형'매개 변수에, 이것은 세포의 크기의 함수입니다. CD71/Ter119 분석은 생체내에 erythropoietic 스트레스를 자신의 응답을하는 동안 erythroid progenitors을 연구하는 데 사용할 수있는 예를 들어, 빈혈 마우스 또는 마우스로 낮은 산소 조건에서 지내게. 또한 적혈구 조혈에 수정된 분자 경로의 구체적인 역할을 평가하기 위해 직접 유전자 변형 성인 마우스 또는 태아의 조직에 erythroid progenitors의 연구를하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 조직의 수확

1. 2-5 ML 차가운 얼룩 버퍼를 (와 호수 (PBS)가 0.2 % BSA와 5mM 포도당을 추가 인산염 버퍼)이있는 튜브를 준비합니다. 이전 조직 수확 얼음 튜브 보관하십시오.
2. 쿨 마우스 적절한 승인 프로토콜에 따라 (예 : CO ₂ 흡입 자궁 전위 다음).
3. 나중에 분석, 혈소판의 예, reticulocyte 백작 CBC 분석을위한 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 또는 헤파린 혈액 수집 튜브에 심장 바늘로 혈액을 그립니다.
4. 1 단계에서 준비를 별도의 튜브에 각각 마우스의 조직을 배치, 비장과 뼈를 수확. 비장에 쉽게 접근할 수는 왼쪽에서 있습니다. 뼈 - 골수, 수확 하나 또는 둘 모두 대퇴골하십시오. 얼음 수확 조직을 유지.
5. 원하는 경우, 비장의 무게. erythropoietic 스트레스 반응을받은 마우스는 비장 중량의 상당한 증가를 보여 가능성이 높습니다.

2. 비장 세포의 준비

1. 사전 moistened 3 ML 주사기 플런저를 사용하여, 부드럽게 40 μm의 살균 셀 스트레이너 (Fisherbrand 카탈로그 번호 22363547 또는 기타)을 통해 비장, 또는 비장의 일부 (이상적으로, 약 10 ⁸ 세포에 해당하는 0.1 그램 이하) 푸시 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 위치. 이 절차를 수행하는 동안 얼음 튜브 보관하십시오. 2 ML의 얼룩 버퍼의 총 스트레이너를 통해 세포를 씻으십시오.
2. 부드럽게 어떤 작은 대단히 짧은 시간을 깰 수있는 긴장 세포 현탁액을 피펫. 필요한 경우, 세포가 다시 변형.
3. 원심 분리에 의해 두 번 세포를 씻고 차가운 버퍼에 다시 일시 중지합니다.
4. hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 일반적인 수확량은 1-2 X 10 ⁸ 셀 / 비장 있습니다. 흐름 cytometry 분석을 위해, aliquote 중 외과의 얼룩 튜브에 샘플 당 1-2000000 세포 (BD 팰컨 폴리스티렌은 왕복 바닥 튜브, 352,008) 또는 U - 96 잘 하단 플레이트 (BD 팰컨 353910). 샘플 얼룩 볼륨은 최종 세포 농도 0.5-1 X 10 ⁷ 셀 / ML 또는 1-2로, 200 μl입니다 X 10 ⁶ 세포 / 200 μl 샘플.

3. 뼈 - 골수 세포의 준비

1. 첨부 26G 바늘, 차가운 얼룩 버퍼로 미리 채워진 1 개 또는 3 ML 주사기를 준비합니다.
2. 명확하게 뼈 시각화하는만큼 대퇴골에 연결된 근육을 제거합니다.
3. 뼈 끝을 가능 날카로운 외과 가위, 대퇴골의 양쪽에서 싹둑, 가까이로 사용합니다. 이것은 대퇴골의 길이를 통해 실행 골수 캐비티로 선두, 각 컷 끝에 작은 구멍을 공개해야합니다.
4. 1 단계에서 미리 채워진 주사기를 사용하여 이러한 구멍 중 하나를 통해 바늘을 삽입하고, 부드럽게 튜브로, 다른 끝에있는 구멍을 통해 골수를 플러시.
5. 위의 비장에 대해서는 40 μm의의 스트레이너 (섹션 2.1 참조)을 통해 얼굴이 붉어지는 부드러운 pipetting하여 세포와 스트레인을 떼어 놓다.
6. 감기 얼룩 버퍼에서 원심 분리하여 세포를 두 번 씻으십시오
7. 세포를 카운트하고 섹션 2.4로 resuspend. 일반적인 수확량은 대퇴골 약 10 ⁷ 세포 수 있습니다.

4. 태아 간 세포의 준비

1. 시간 초과 - 임신 여성 생쥐를 준비하려면 저녁에 짝짓기에 마우스를 설정, 10 다음날 오전하기 전에 질 플러그에 대한 검사, 질 플러그가 감지되는 일은 일 0.5 간주됩니다. 베티 직원들은 임신 여성을 식별이 기술에 익숙하지 않은 수사 도움을 드릴 수 있습니다. 임신도 모니터링 마우스 무게에 의해 결정하실 수 있습니다.
2. 시간 초과 - 임신 여성 생쥐는 임신의 14.5에 12.5 일에 학살하고 있습니다. 자궁 뿔은 얼음처럼 차가운 문화 매체 또는 얼룩 버퍼를 포함하는 페트리 - 그릇에 제거됩니다.
3. 배아는 각 자궁에서 제거되며 태아 간장을 해부합니다. 해부 현미경은 배아 일 12.5 (E12.5) 이하가 필요합니다.
4. 간은는 버퍼 pipetting에 의해 기계적으로 dissociated 수 있으며, 96 잘 접시 개별적으로 처리하거나, 또는 실험적인 요구에 따라, 함께 풀링됩니다.
5. E13.5에서 태아의 간은 ~ 10 ⁷ 세포를했다. 전지는 버퍼를 염색법으로 두 번 씻어과 흐름 cytometric 분석 1-2 X 10 ⁶ 세포 / 200 μl 샘플에서 resuspended 있습니다.

5. 유동세포계측법에 대한 항체 염색법

1. 다음 사항을 포함, 컨트롤 샘플을 제외하고, 모든 샘플에 사용되는 사전 믹스를 얼룩 차 항체를 준비 :
   • 200μg/ml의 최종 농도 ChromePure 토끼 IgG (잭슨, 015-000-003). 병에서 재고 농도를 (이것은 다를 수 있음) 확인합니다. 이것은 마우스 세포에서 FC 수용체를 차단하는 데 사용되며이에 사용할 수 있습니다 다른 종족은 마우스 IgG 또는 쥐 IgG 수 있습니다. 종 선택은 그 종을 사용할 수없는 경우에는 기본 쥐 / 마우스 / 토끼 항체, 이차 항체에 대한 감독의 얼룩 프로토콜의 잠재적인 존재에 의해 결정됩니다차단 항체로 D. 또는 5 % 토끼 혈청 IgG는 정화의 장소에서도 사용할 수 있습니다. 자세한 대안은 단클론 항체 또는 마우스 FC 수용체에서 감독 팹 조각의 사용이다. 아래의 기본 프로토콜은 이차 항체가 포함되지 않습니다 따라서 세 종류의 중 IgG가 사용할 수 있습니다.
   • CD71 - FITC, 희석 1:200 (재고 0.5mg/ml, BD - Biosciences, 553,266)
   • Ter119 - PE, 1:200 (재고 0.2mg/ml, BD - Biosciences, 553,673)를 희석
   • 추가 항체가 관심의 표면 epitopes에서 감독, 예를 들어 항체가 파 또는 FasL ^{(1,2 참조)에서} 감독. 반전 튜브 2-3 배 부드럽게 항체 솔루션을 섞는다.
2. 각각의 세포 샘플을 미리 믹스 200 μl를 추가하고 부드럽게 세포를 다시 일시 중지합니다.
3. 다음과 같이 제어 세포 샘플을 준비 :
   • '흠​​없는'이 세포가 버퍼를 얼룩의 왼쪽과 세포의 배경 autofluorescence를 제공​​합니다.
   • '단일 색상'컨트롤 : 하나의 컨트롤 프로토콜에 사용되는 각각의 항체 / 컬러가 필요합니다. 이러한 컨트롤의 세포는 직접 복합 일차 항체와 중 스테인드 또는 차 항체와 복합 보조 항체 모두 있습니다. 이러한 컨트롤은 채널 사이의 스펙트럼 중복에 대한 해결하기 위해 사용됩니다.
   • '형광 빼기 1'(FMO) 컨트롤 : 하나의 제어 프로토콜의 각 항체 / 컬러가 필요합니다 : 세포를 제외하고 프로토콜의 모든 색상 / 항체 물들일 수있는 색상 / 이것은 FMO 컨트롤하는 항체. 특정 채널에 대한 FMO 컨트롤은 해당 채널에 대한 진정한 배경을 제공합니다. 그것은 불특정 같은 isotype의 항체 및 항체 검사 (isotype 제어)와 같은 형광 표시가있는 복합을 포함할 수 있습니다.
4. 기본 항체에 품어 샘플 및 관련 컨트롤 45 '1 시간 어둠 속에 (아이스 버킷에 알루미늄 호일 커버를 넣어)에 얼음에 얼룩.
5. 부화의 끝에, 4 약 400 XG ° C. 3 '5'에 대한 각각의 샘플 튜브와 스핀에 얼룩 버퍼의 3ml를 추가하여 세포를 씻어 96 잘 번호판을 사용하는 경우, 200 μl의 볼륨에있는 세포가 세 번 씻으십시오.
6. 관련있다면, 보조 항체가 얼룩 적용됩니다. 적용 및 최초의 항체가 얼룩에 관해서 씻으십시오.
7. 관련있다면, Annexin V와 얼룩은 제조 업체의 지침과 같이 hepes 버퍼를 사용하여 부화의 끝 부분에 적용됩니다. 이 얼룩은 룸 온도에서 15 분 동안 적용, 또는 얼음에서 1 시간입니다.
8. 세포는 죽은 세포를 제외, 셀 스며들지 DNA의 염료를 포함하는 솔루션을 얼룩에 흐름 cytometry 분석을 위해 다시 중지됩니다. 여러 DNA의 염료가 Propidium 이우 7 - 아미노 actinomycin D ​​(7AAD) 또는 DAPI를 포함하여, 사용할 수 있습니다. 이들 사이에서 선택은 특정 항체 염색법에 촬영한 채널을 제공 가능한 채널, 그리고 흐름 cytometer에서 사용 가능한 채널에 따라 달라집니다. 7AAD는 BD - Biosciences (559925)에서 얻은하고 제조 업체의 지시에 따라 사용됩니다. DAPI의 얼룩 들어, (로체, 고양이 # 236276) 분말에서 dimethylformamide (DMF)에 1mg/ml의 주식을 -20 ° C에서 보관하고, 버퍼를 얼룩의 1:15,000으로 1:10,000를 희석.

6. 흐름 cytometric 정렬

1. 세포는 CD71에 대한 항체, Ter119, 혈통의 마커와 같은 흐름 cytometric 분석 (섹션 5) 설명 생존의 염료로 분류됩니다. 라벨 동안 세포 농도가 5 증가 수 X 10 ⁷ / ML.
2. 혈통 마스터 믹스를 만들기 위해 다음과 항체의 각각의 동일한 음량을 혼합 :
   • FITC 랫 안티 - 마우스 CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553,848
   • FITC 랫 안티 - 마우스 CD45R/B220 RA3 - 6B2, BD Pharmingen 553,087
   • FITC 햄스터 방지 마우스 CD3e 145 - 2C11, BD Pharmingen 553,061
   • FITC 쥐 방지 마우스 CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557,396
   • FITC 랫 안티 - 마우스 LY - 6G 및 LY - 6C (GR - 1) RB6 - 8C5, BD Pharmingen 553,126
   • (이것은 모든 0.5 MG / ML 각 개별 항체 주식의 1:400 희석하는 것과 동일합니다) 1:80에서 마스터 믹스를 사용합니다.
3. 저압 정렬 조건과 넓은 노즐을 사용합니다. 아리아에 대한 (BD Biosciences) 우리는 100 μ 노즐, 20 PSI 압력을 사용합니다.
4. 수집 버퍼 : PBS는이 20 % 태아 소 혈청을 추가했습니다.
5. 정렬 인구의 purities를 확인하려면 (7AAD 또는 이와 유사한 것) 생존의 염료를 포함하는 버퍼의 각 샘플에서 작은 나누어지는을 다시 실행합니다.

7. 대표 결과 :

성인 뼈 - 골수 또는 비장의 CD71/Ter119 얼룩이 표시된 ProE, EryA, EryB 및 EryC (그림 ^1), 넷 하위 집합의 발달 순서를 식별합니다. Morphologically, 이들은 점점 더 성숙 erythroblasts 일치합니다. 그림 1은 매우 작은 이벤트 (핵, 빨강 전지 포함), 집계 세포와 죽은 세포를 삭제 데이터 분석 단계에서 게이팅 순서를 보여줍니다.

세포 - 표면 단백질의 표현은 Ter119 및 CD71 얼룩 같은 시간에 관련된 항체를 추가하여이 하위 집합 각각에 대해 동시에 측정할 수 있습니다. 그림 1은 죽음 수용체 파 ¹ 셀 표면 표현의 예를 보여줍니다. 이 측정은 EPO와 주입 생쥐에서 실시하거나, 컨트롤 마우스에 식염수에 주입했다. 그것은 EPO는 생체내 ¹ EryA 인구의 파의 표현을 억제 것이 분명합니다.

세포내 단백질 또는 세포주기 상태를 표현 또한 각 하위 집합에있는 세포에 대해 측정할 수 있습니다. 그림 2는 갓 수확 골수 세포의 대표적인 세포주기 분석을 보여줍니다. 이러한 측정치가 CD71와 Ter119와 함께 세포 표면 얼룩뿐만 아니라, 필요, 세포내 라벨 (토론 섹션을 참조) 세포의 고정과 permeabilization.

태아 간 년 아닌 erythroid 세포는 처음에는 CD41에 대해 아무것도 없습니다 '린 -'세포, 맥 - 1, GR - 1, B220 및 인 경우에는 3 번 CD에 들어 (그림 3)에 게이팅에서 제외됩니다. 나머지 세포은 하위 분할 S0 S5 6 하위 집합로. 태아 간장 세포의 정확한 패턴 (토론 섹션을 참조) 배아 나이에 따라 달라집니다. E13.5 태아 간에 S3의 부분 집합의 대표적인 세포주기 분석 (그림 4) 표시됩니다.

그림 1 마우스 비장의 CD71/Ter119 erythroid의 하위 집합 A.의 게이팅 전략 :.. 비장 세포를 처리하고 CD71, Ter119 및 파에서 감독 항체로 분류되었습니다. 이 그림은 데이터 수집 단계 다음과 같은 분석 전략을 보여줍니다. 히스토그램이 모든 인수 이벤트를 보여줍니다. 대각선 게이트 doublets 또는 더 큰 합산 제외하고 단일 세포 될 가능성이 이벤트를 나타냅니다. 이 게이트에있는 세포는 더 히스토그램 II에서 분석하고 있습니다. 여기에 아주 작은 이벤트 가능성이 핵이나 먼지는 제외됩니다. 문이 세포는 막 - 투과 apoptotic 세포 가능성이 높습니다 DAPI - 긍정적인 세포, 추가 분석에서 제외됩니다 히스토그램 III에 표시됩니다. 히스토그램 IV가 가능한 비장 세포의 결과 인구를 보여줍니다. ProE 게이트는 CD71 ^높은 Ter119 ^중간 세포가 포함되어 있습니다. Ter119 ^높은 세포는 더욱 막대 그래프로 분석 아르 V. 여기 CD71 ^높은 세포는 덜 성숙, 대형 'EryA'erythroblasts (CD71 ^높은 Ter119 ^높은 FSC ^높은)와 작은 더 성숙한 'EryB'erythroblasts (CD71 ^높은 Ter119 ^높은 FSC ^낮은)로 세분화 아르 . 가장 성숙한 erythroblast 부분 집합은 EryC (CD71 ^낮은 Ter119 ^높은 FSC ^{낮은)입니다.} 히스토그램 VI는 기저 상태의 생쥐 (식염수에 주입), 그리고 EPO의 단일 복용과 함께 주입 생쥐에 특히 EryA 부분 집합의 셀 표면 파의 표현을 나타냅니다. 파 항체와 얼룩 것은 CD71/Ter119 얼룩과 동시에 진행되었습니다. 표시된 하위 집합의 각 정렬 세포의 B. Cytospin 준비가. 전지는 Giemsa 물들일과 Diaminobenzidine와 후자는 브라운 헤모글로빈과 얼룩이 생성되었습니다. Cytospin 데이터는 원래 리우 외 출판되었습니다., 피가. 2006 7월 1일, 108 (1) :123 - 33. Epub 2006 3월 9일.

그림 2. 마우스 골수에서 CD71 ^높은 Ter119 ^높은 erythroblasts의 세포주기 분석. 마우스는 BrdU와 intraperitoneally을 주입했고, 비장이나 뼈가 골수는 30~60분 나중에 수확했다. 세포 고정과 permeabilized과 (고정, permeabilization 및 BrdU - 얼룩 프로토콜 제조 업체의 지시에 따라되었습니다), CD71 및 Ter119에 대한 스테인드 것에 BrdU에 감독 단클론 항체 자신의 복제 DNA에 BrdU의 설립에 대한 스테인드했다 외에 하였다. BrdU 양성 세포주기의 S - 단계에 있습니다. 계면 세포가 BrdU - 부정하며 DNA 염료 7AAD을 사용하여 G1이나 G2 / M 단계로 해결될 수 있습니다.

그림 3 마우스 태아의 간장에서 CD71/Ter119 erythroid의 하위 집합 A.의 게이팅 전략 :.. 태아 간 세포는 CD71, Ter119에 대한 라벨이 붙지만, 비 erythroid 혈통 표시 ( '린')에서 감독 FITC - 라벨 항체의 칵테일. 가능한 세포 (7AAD 음수) 린 표현 분석되었고, 린 - 전지 더욱 S0에 S5 erythroid의 하위 집합으로 세분화됩니다. 영거, E13 태아 간가 성숙 S4/S5 하위 집합에있는 세포의 부재에 의해 표시된 덜 성숙 erythroblasts,로 구성되어 있습니다. 표시된 하위 집합의 각 정렬 세포의 B. Cytospin 준비가. 전지는 Giemsa 물들일과 Diaminobenzidine와 후자는 브라운 헤모글로빈과 얼룩이 생성되었습니다. Cytospin 데이터는 원래 P되었습니다팝 외에 ublished, 플로스 Biol 8 일 (9) :. e1000484가. 도이 : 10.1371/journal.pbio.1000484.

그림 4. 태아 간 erythroid의 하위 집합의 세포주기 분석. 임신한 생쥐는 BrdU와 함께 주입했고, 태아의 간은는 permeabilized, 고정, 30~60분 나중에 수확하고, CD71, Ter119 및 BrdU에 대한 항체 물들일되었습니다. S3 세포의 세포주기 상태가 표시됩니다.

Discussion

흐름 cytometric 방법은 세포 표면 마커, 단백질 발현, 세포 생존, phospho 특정 항체 ³ 세포주기 상태를 사용하여 세포 신호를 포함하여 형광 - 복합 특정 항체 혹은 리간드와 검색 수있는 세포 기능의 동시 조사 수 있습니다. 이러한 성능은 신선하게 고립 erythropoietic 조직의 맥락에서, 분화 단계 특정 하위 집합의 개수 각 만들 수 있습니다. 이 방법은 따라서 erythropoietic 자극의 다양한 반응이나 유전자 돌연변이의 결과로, erythropoietic 시스템의 서로 다른 수준에서 기능 및 분자 변화를 평가하실 수 있습니다.

대한 항체 교차 반응없이도 및 교차 반응은 조직 특정 수 있습니다. 그것도 NULL 또는 노크 다운 세포 모델을 사용, 심지어는 이전 테스트 항체를 위해, 확인하는 것이 erythropoietic 조직의 맥락에서 그들의 특이성 중요합니다.

특정 er...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
파 - 비오틴	BD Pharmingen	554256
Streptavidin - APC	분자 프로브	S868
40 μm의 무균 셀 스트레이너	Fisherbrand	22363547
외과의 얼룩을위한 폴리스티렌 왕복 하단 튜브	BD 팰컨	352008
U - 96 바닥 잘 플레이트	BD 팰컨	353910
ChromePure 래빗 IgG	잭슨 ImmunoResearch	015-000-003
CD71 - FITC (재고 0.5mg/ml)	BD - Biosciences	553266
Ter119 - PE (재고 0.2mg/ml)	BD - Biosciences	553673
7AAD	BD - Biosciences	559925
DAPI 분말	로체	236276
FITC 랫 안티 - 마우스 CD41 MWReg30	BD Pharmingen	553848
FITC 랫 안티 - 마우스 CD45R/B220 RA3 - 6B2	BD Pharmingen	553087
FITC 랫 안티 - 마우스 CD411b/Mac-1 M1/70	BD Pharmingen	557396
FITC 랫 안티 - 마우스 LY - 6G 및 LY - 6C (GR - 1) RB6 - 8C5	BD Pharmingen	553126
FITC 햄스터 방지 마우스 CD3e 145 - 2C11	BD Pharmingen	553061
APC BrdU 흐름 키트	BD Pharmingen	557892
Annexin V - 비오틴	BD Pharmingen	556418