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방법 논문

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO 적혈구 조혈

12.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/2813

⸱

2011년 7월 16일

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

이 논문에서

요약

예 생체내 프로토콜 설명 조혈 줄기 / progenitors에서 성숙한 인간의 적혈구를 생성합니다. 또한 우리는 최저 기본 erythroid 세포에 전사 인자의 TAL1를 효율적 lentiviral 배달 방법을 설명합니다. lentivirus 매개 유전자 전달의 효율성은 GFP 표현 바이러스를 사용하여 증명합니다.

초록

적혈구 조혈은 세포 분화 연구를 일반적으로 사용되는 모델 시스템입니다. 적혈구 조혈 동안, pluripotent 성인 인간의 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 oligopotent progenitors, 헌신 엽 성의 전구 물질과 성숙 적혈구 1로 구분. concomitantly 다른 세포 유형 2와 관련된 유전자를 억압하는 동안이 과정은 구체적인 전사 요소 혈통 특정 유전자를 활성화 의하여 유전자 발현의 수준에서 큰 부분을 규제합니다. 적혈구 조혈을 조절 전사 요인에 연구는 종종 분화 3-5의 주어진 단계에, 어느 정도, erythroid 세포를 나타내는 인간과 murine 세포 라인을 사용하여 수행됩니다. 그러나 변형 세포 라인은 부분적으로만 erythroid 세포를 모방 수 있으며 가장 중요한 그들은 하나가 comprehensibly 최종 erythroid 운명을 향해 여러 단계를 통해 세포의 진행으로 발생하는 역동적인 변화를 연구하는 것을 허용하지 않습니다. 따라서, 현재의 과제는 게놈과 proteomics 실험을 수행하기 위해 충분 수량 분화의 여러 단계에서 기본 HSCs과 erythroid 세포의 비교적 동질적인 인구를 얻을 수있는 프로토콜의 개발 남아 있습니다.

여기 우리는 코드 혈액, 골수, 또는 G - CSF (leukapheresis)을 동원 성인 말초 혈액 중의 고립되었습니다 인간의 조혈 줄기 / 전구 세포에서 erythroid 분화를 유도하기 위해 전직 생체내 세포 문화 프로토콜을 설명합니다. 처음 도이 실험실 6 개발한이 시스템은 문화, 골수 microenvironment을 모방하기 위해 mesenchymal 세포에 크린 시토킨 및 공동 문화를 사용합니다. 이 전 생체내 차별 프로토콜을 사용하여, 우리는 erythroid progenitors의, 독점적 erythroid의 혈통과 enucleated 적혈구의 무대에 완전한 성숙을 향해 분화의 유도의 강력한 증폭을 관찰합니다. 따라서,이 시스템은 erythroid의 혈통을 따라 조혈 줄기 세포의 진전으로 transcriptional 규제의 분자 메커니즘을 연구하는 기회를 제공합니다.

transcriptional 수준에서 적혈구 조혈을 공부하면 기본 erythroid 세포의 이상 - 명시적 또는 최저의 특정 요소 수있는 능력이 필요합니다. 이러한 목적을 위해, 우리는 분리와 비 분리 전지 7 모두의 효율적인 감염을 허용 lentivirus - 중재 유전자 전달 시스템을 사용합니다. 여기서 우리는 효율적으로 기본 인간 erythroid 세포에 전사 인자의 TAL1을 최저 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 또한, GFP의 표현이 90 % 가까이 lentiviral 감염의 효율성을 보여줍니다. 따라서, 우리의 프로토콜은 규제 전사 요소의 네트워크 제어하는​​ 적혈구 조혈의 특성화를위한 매우 유용한 기능을 제공합니다.

프로토콜

파트 I. 인간 조혈모/전구세포의 ex vivo 적혈구 생성

1. CD34+ 인간 조혈모/전구세포의 분리

조혈모세포(HSCs)와 초기 전구세포가 혼합되어 있는 인간 CD34+ 세포군8은 제대혈, G-CSF로 동원된 말초혈액(백혈구 성분 채집술) 또는 골수에서 수집합니다(그림 1-Step1). 제대혈이나 말초혈액을 사용하는 경우, 단계 1.2로 바로 진행하십시오. 골수를 사용하는 경우, 단계 1.1부터 시작하십시오. 시약 및 장비는 표 1을 참조하십시오.

별도로 명시되지 않는 한, 이 단계는 멸균 조건(즉, 후드 내) 및 RT에서 수행됩니다.

  1. 골수 단일 세포 현탁액 준비:
    1. 0.02% collagenase B와 100 U/ml DNase 1이 포함된 RPMI 1640 10배 부피로 골수를 재현탁하십시오.
    2. 밸런스 쉐이커에서 45분 동안 부드럽게 혼합하십시오.
    3. 세포를 30μm 나일론 메쉬로 여과하십시오.
  2. Ficoll 밀도 구배 원심분리를 이용하여 저밀도 단핵구(MNCs)를 분리하십시오.
    1. 2% 태아 송아지 혈청(FBS)과 2mM EDTA가 포함된 PBS를 혈액 또는 골수 현탁액 부피의 2~4배만큼 가하여 희석한다. 참고: 부피가 클수록 단핵세포(MNC)의 순도가 높아집니다.
    2. 50 ml 원추형 튜브에 희석된 세포 현탁액 35 ml를 Ficoll-paque 15 ml 위에 조심스럽게 층을 이루도록 얹습니다. 브레이크를 끈 스윙 버킷 로터를 사용하여 400g에서 30분 동안 원심분리합니다.
    3. 중간층의 단핵구(MNC) 층이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거하십시오.
    4. (MNC가 포함된) 중간층을 새로운 50 ml 원추형 튜브로 옮깁니다.
    5. 2% FBS와 2 mM EDTA가 포함된 PBS를 튜브에 가득 채운 후, 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합하고 상온에서 300g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 제거한다.
    6. 혈소판을 제거하기 위해 세포 펠릿을 2회 더 세척하십시오. 참고: 이 단계는 CD34의 순도를 높여줍니다.+ 세포
    7. 세포 현탁액 20 μl를 취하여 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 넣습니다. 적혈구 용해 완충액(Red Blood Cells Lysis Buffer, 표 1) 200 μl를 첨가하고 실온(RT)에서 2분간 배양합니다. 이 현탁액 18 μl를 혈구계수기(hemocytometer)에 넣고 핵이 있는 단핵구(MNCs)의 수를 측정합니다.
    8. MNC는 즉시 사용하거나 -10°C에서 동결하여 보관할 수 있습니다.8 10% DMSO가 포함된 세포 배양 배지 내의 ml당 세포 수이며, 액체 질소에 보관됨.
  3. CD34 분리+ 양성 면역자기 선택법을 통한 세포 분리(그림 1-단계 1)
    당사는 CD34 Microbead Kit(단클론 마우스 항-인간 CD34 항체가 결합된 마이크로비드 용액과 인간 IgG를 포함하는 FcR Blocking Reagent 용액으로 구성)를 두 개의 LS Mini-Macs 컬럼, autoMACS Running Buffer 및 MiniMACS Separator와 함께 사용합니다(표 1). 아래에 2.3x10^6[단위 누락/원문 유지]부터 시작하는 프로토콜을 기술합니다.8 단핵세포(MNCs). 서로 다른 수의 세포를 사용하는 경우, 부피를 그에 맞게 늘리거나 줄여야 합니다. 또한, 최대 2x10까지의 경우8 MNCs의 경우, LS MiniMacs 컬럼 대신 MS MiniMacs 컬럼을 사용할 수 있습니다.
    세포 표면의 항체 캡핑(capping)과 비특이적 세포 라벨링을 방지하기 위해 세포와 시약을 차갑게(4-8°C) 유지하십시오.
    1. 2.3x10이 포함된 펠렛을 재현탁하십시오.8 690 μl의 Running Buffer(10^8 MNCs당 300 μl, 최소 부유 부피 300 μl 필요)에 MNCs를 현탁한 후 15 ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
    2. FcR 블로킹 시약 230 μl를 첨가하십시오.
    3. CD34 MicroBeads 용액 230 μl를 첨가하십시오.
    4. 손으로 잘 섞은 후 4°C에서 30분 동안 배양하십시오.
    5. Running Buffer 10ml를 첨가하여 세포를 세척한 후, 300g에서 10분간 원심분리합니다.
    6. 상층액을 완전히 흡입하여 제거하십시오.
    7. 세포를 1.2 ml의 Running Buffer에 재부유시키십시오 (세포 10[단위]당 버퍼 0.5 ml 사용).8 단핵구(MNCs) 주의: 자기 분리 전 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 중요합니다. 필요한 경우, 세포 덩어리를 제거하기 위해 세포를 30μm 나일론 메쉬에 통과시키십시오.
    8. MiniMACS Separator의 자기장 내에 LS 컬럼을 배치하여 준비합니다.
    9. 컬럼을 3 ml의 Running Buffer로 세척하십시오.
    10. 세포 현탁액 1.2ml를 컬럼에 도포하십시오.
    11. 통과액(flow-through)을 수집하여 CD34의 수율과 순도를 확인하는 데 사용하십시오.+ 세포 분리. 또는 이 분획에 포함된 세포를 동결하여 액체 질소에 보관하십시오. 참고: 이 분획에는 표지되지 않은 세포가 포함되어 있으며, 일부 표지된 CD34 세포가 포함될 수 있습니다.+ 컬럼에 부착되지 않은 세포.
    12. 컬럼을 3 ml의 Running Buffer로 3회 세척하고, 세척액을 모두 모아 위에서 설명한 flow-through 분획과 동일한 방식으로 사용하십시오.
    13. 컬럼을 자석에서 분리하여 15 ml 폴리프로필렌 수집 튜브에 놓습니다.
    14. 세포를 용출하려면, 컬럼에 Running Buffer 5 ml를 가한 후 즉시 표지된 CD34를 씻어내십시오.+ 플런저를 컬럼 안으로 강하게 밀어 넣어 세포를 고정합니다.
    15. 새로 준비한 LS 컬럼에 세포를 통과시켜 컬럼 정제 과정(단계 h에서 n)을 반복하십시오. 참고: 이는 CD34의 순도를 높여줍니다.+ 세포. 2.3x10의 현탁액으로부터8 백혈구 성분 채집술(leukapheresis)을 통해 분리된 단핵구(MNCs)로부터, 일반적으로 1.1x106 CD34+ 특정 순도의 세포 > 95±3% (그림 1-단계 1).
    16. 10% DMSO가 포함된 배양 배지에서 세포를 동결하여 액체 질소에 보관하거나, 곧바로 2단계로 진행하십시오.

2. 세포 배양에서의 적혈구 분화

CD34+ 세포는 6에서 인용한 4단계 프로토콜(그림 1-단계 2)에 따라 하이드로코르티손과 특정 조합의 사이토카인을 순차적으로 공급하며 보충된 IMDM 배지에서 배양합니다. 세포 성장과 적혈구 분화를 확인하기 위해 전체 과정 동안 일련의 테스트를 수행합니다.

배양을 시작하는 데 필요한 CD34+ 세포 수는 실험 규모에 따라 달라집니다. 일반적으로 유전자 발현 연구의 경우, 10 ml 배지 내에 0.1x106 CD34+ 세포를 넣어 소규모 배양을 수행하며, 과정 전반에 걸쳐 여분의 세포를 동결 보관하여 소량의 부피를 유지합니다. 단백질 추출이 필요한 연구에서는 더 큰 규모로 배양을 진행합니다. 여기서는 성분채집술(leukapheresis)을 통해 분리한 ~7x106 CD34+ 세포로 시작하는 대규모 실험에 대해 설명합니다.
전 과정에서 멸균 조건이 유지되어야 합니다. 시약은 표 1, 2, 3을 참조하십시오.

  1. 시약 준비
    1. 표 2에 기술된 대로 보충제가 첨가된 IMDM 배지를 준비하고, 40ml씩 분주하여 -20°C에서 냉동 보관하십시오(사전 준비 가능).
    2. 표 3에 설명된 대로 하이드로코티손과 사이토카인의 스톡 용액을 준비하십시오.
  2. 단계 1: 0-11일차
    조혈 세포는 하이드로코르티손(HC), 줄기세포 인자(SCF), 인터루킨 3(IL-3) 및 에리스로포이에틴(EPO)이 첨가된 보충 IMDM 배지에서 배양합니다(표 3). 단계 2를 준비하기 위해 MS-5 마우스 골수 기질 세포(표 1)를 증식시킵니다.
    • 0일 차:
      1. 보충제가 첨가된 IMDM 배지 120ml를 미리 가온한 후, HC, SCF, IL-3 및 EPO를 첨가한다(표 3).
      2. 7x10을 해동하십시오.6 CD34+ 먼저 바이알을 37°C 항온수조에 넣어 세포를 해동합니다. 세포가 완전히 녹기 전, 미리 데워둔 배지 1ml를 첨가한 후 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 바이알을 배지 2ml로 세척하여 15ml 튜브로 옮깁니다.
      3. 세포 현탁액에 배지 6 ml를 첨가하고, 튜브를 반전시켜 혼합한 후 200 g에서 5분간 원심분리하십시오.
      4. 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠렛을 10 ml의 신선한 배지에 다시 부유시킵니다.
      5. 10 μl의 세포 현탁액과 10 μl의 Trypan Blue 용액을 혼합한 후, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 생존 세포 수를 측정한다(표 1). 참고: 해동 과정 중 세포 사멸률이 약 25%이므로, 생존 세포의 농도는 ~0.5x10^6/mL가 되어야 합니다.6 cell/ml.
      6. 테스트를 위해 세포 현탁액 약 3ml를 따로 보관하십시오(단락 6 참조).
      7. 남은 7ml를 T-175 플라스크로 옮기고 배지 63ml를 추가하여 0.05x106 70 ml에 cell/ml 농도로 분주하고 플라스크를 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
    • 1일 차:
      1. Glutamax가 포함된 $\alpha$MEM(표 1), 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 $\mu$g/ml 스트렙토마이신으로 구성된 MS-5 세포 배양 배지 85 ml를 미리 데워둡니다.
      2. 각각 2x10^6개의 세포가 파종된 150mm x 25mm 원형 배양 접시 3개를 준비하십시오.6 0.08x10의 세포 수를 얻기 위해 25 ml 배지에 MS-5 세포를 분주합니다.6 cell/ml의 농도로 분주하여 37°C 배양기에 넣는다. 참고: 낮은 계대 배양(<20) MS-5 세포. 컨플루언트(confluent) 상태의 배양 세포는 0.05% EDTA가 포함된 트립신을 사용하여 3일마다 1:5 비율로 분할함으로써 확장 배양해야 한다.
    • 2일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 조혈 세포 수를 측정함으로써 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 세포(즉, 배양액 약 20ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 참고: 본 연구진의 경험에 따르면, 처음 2일 동안 세포 사멸률이 30~50%를 초과할 수 있으며, 이에 따라 최종 세포 농도는 대개 0일차의 농도와 비슷하게 유지됩니다(그림 2).
      2. 부착되지 않은 MS-5 세포가 제거되도록 주의하며, MS-5 배양액을 25 ml의 신선한 배지로 교체하십시오.
    • 4일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 조혈 세포 수를 측정함으로써 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 세포(예: 배양액 약 10ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 참고: 이 시점에서 세포는 ~와 함께 증식하기 시작해야 합니다. >~0.2x10 농도의 살아있는 세포 중 75%6 cells/ml. 세포는 1-2x10^6 cells/ml 농도로 동결할 수 있습니다.6 10% DMSO가 포함된 보충 IMDM 배지 내의 cell/ml이며 액체 질소에 보관됨.
      2. 남은 약 40ml의 배양액을 T-175 플라스크로 옮기고, 최종 부피가 150ml가 되도록 HC, SCF, IL-3 및 EPO가 포함된 보충 IMDM 배지(표 3)를 충분히 추가한다. 참고: 세포 농도는 약 0.05x10이어야 합니다.6 cell/ml.
      3. 0.05% EDTA 트립신을 사용하여 60-70% 정도 합류(confluent)된 MS-5 세포를 새로운 150mm x 25mm 원형 배양 접시에 1:5 비율로 희석하여 확장 배양하십시오. 최종 세포 농도는 약 0.08x10^6/mL가 되어야 합니다.6 cell/ml. 참고: 일반적으로 디쉬 하나를 5배로 확장할 수 있으므로, 약 0.08x10^6 cells/mL 농도의 MS-5 세포가 담긴 디쉬 15개를 준비해야 합니다.6 cell/ml.
    • 6일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 조혈 세포를 계수해 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 수의 세포(즉, 배양액 약 5 ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 주의: 세포가 매우 활발하게 증식하는 단계이므로, 세포 농도를 1.5x10⁶ 이하로 유지해야 합니다.6 cell/ml. 세포 농도가 이보다 높을 경우, HC, SCF, IL-3 및 EPO가 함유된 신선한 보충 IMDM 배지를 추가하십시오.
    • 7일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 사멸 세포를 제외한 조혈 세포의 수를 측정하십시오. 참고: 본 연구진의 경험에 따르면, 세포는 보통 1.5x10의 밀도에 도달합니다.6 7일 차의 ml당 세포 수.
      2. 세포 농도가 약 0.8x10^6 cells/mL로 유지되도록 배지를 충분히 추가하십시오.6 cell/ml 참고: 일반적으로 HC, SCF, IL-3 및 EPO가 포함된 신선한 보충 IMDM 배지 100 ml를 추가하여 ~0.8x10 농도의 세포 245 ml를 얻습니다.6 cells/ml
      3. Trypsin 0.05% EDTA를 사용하여 60-70% 정도 컨플루언시(confluency) 상태인 MS-5 세포를 T-175 플라스크(디쉬 대신 사용)에 1:5 비율로 희석하여 확장 배양한다. 최종 세포 농도는 약 0.08x10^5 cells/cm^2가 되어야 한다.6 cell/ml. 참고: ~0.08x10^6 cells/mL 밀도의 MS-5 세포가 담긴 플라스크 61개6 cell/ml로 준비해야 합니다. 남은 MS-5 세포는 동결하여 액체 질소에 보관하십시오.
    • 8일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 조혈 세포를 계수하여 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 수의 세포(즉, 배양액 약 5 ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 참고: 세포 밀도는 약 1x10이어야 합니다.6 cell/ml.
      2. SCF와 EPO만 포함된 보충된 IMDM 배지 2L를 미리 데워 둡니다(표 2 및 3).
      3. ~200x10^6개의 세포를 포함하는 조혈 배양액 200ml를 수확합니다.6 세포), 200 g에서 10분간 원심분리하고, 상청액을 흡입 제거한 뒤 세포 펠릿을 SCF와 EPO가 첨가된 40 ml의 보충 IMDM 배지에 재현탁한다.
      4. 세포 현탁액을 8개의 T-175 플라스크에 분주하고(플라스크당 5ml), 각 플라스크에 SCF와 EPO가 포함된 보충 IMDM 배지 245ml를 첨가하십시오. 참고: 현재 각각 0.1x10 농도의 세포 250ml가 들어 있는 플라스크 8개가 준비되었습니다.6 cells/ml.
      5. 8일 차의 잔여 세포(~40ml)는 1-2x10^6 cells/vial의 밀도로 동결 보관할 수 있습니다.6 10% DMSO가 포함된 보충 IMDM 배지 내의 ml당 세포 수이며, 액체 질소에 보관됨.
    • 10일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 조혈세포를 계수함으로써 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 수의 세포(즉, 배양액 약 5ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 참고: 세포 밀도는 ~1x10이어야 합니다.6 cells/ml.
  3. 단계 2: 11-15일 차
    세포의 약 절반은 추후 사용(예: 핵 추출)을 위해 수확합니다. 나머지 적혈구계 세포는 EPO가 포함된 보충 IMDM 배지(표 2 및 3)에서 MS-5 세포와 공동 배양합니다. 적혈구계 세포는 3~4일마다 새로운 MS-5 층으로 옮겨주어야 합니다.
    • 11일차:
      1. Trypan blue를 사용하여 사멸 세포를 제외한 적혈구계 세포 수를 측정한다. 참고: 세포 밀도는 약 1.5x10^6/mL가 되어야 합니다.6 cell/ml.
      2. 1x PBS 1L, 보충제가 첨가된 IMDM 배지 400ml 및 EPO가 함유된 보충제가 첨가된 IMDM 배지 5L(표 2 및 3)를 37°C에서 예열하십시오.
      3. 15x10에 해당하는 부피의 배양액을 따로 보관하십시오.8 세포(예: 250 ml 플라스크 약 4개)를 준비하고 e단계로 진행합니다.
      4. 남은 세포(예: 15x10^6개)8)를 원추형 튜브에 수집하여 450 g에서 10분간 원심분리한 후, 0.1mM DTT가 포함된 차가운 MS30 완충액(표 5) 최대 10(단위 생략됨)을 사용하여 재현탁한다.8 cell/ml 농도로 조절하고, 액체 질소로 급속 동결한 후 -80°C에 보관하여 추후 사용(예: 핵 추출물)한다.
      5. 합류된(confluent) MS-5 세포가 들어 있는 플라스크 50개를 각각 20ml의 1xPBS로 세척하고, 즉시 각 플라스크에 EPO가 포함된 신선한 보충 IMDM 배지 80ml를 첨가한다. 참고: 플라스크의 수가 많으므로 한 번에 4개의 플라스크씩 처리합니다. 정확하게는, 인큐베이터에서 합류(confluent) 상태의 MS-5 세포가 담긴 플라스크 4개를 꺼내어 1xPBS로 세척한 후, 배지 80ml를 첨가하고 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 모든 플라스크의 준비를 마치고 인큐베이터에 넣으면 단계 f로 진행합니다. 대규모 공정으로 인해 처리해야 할 플라스크의 수가 많으므로, 두 사람이 동시에 이 단계들을 수행하는 것이 효율적입니다.
      6. 15x10에 해당하는 양을 원심분리하십시오.8 적혈구 세포가 담긴 4개의 원뿔형 튜브를 450 g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거한다.
      7. 첨가물이 포함된 IMDM 배지 100ml씩을 사용하여 4개의 세포 펠렛을 세척합니다.
      8. 각 세포 펠렛을 EPO가 함유된 보충 IMDM 배지 250 ml에 재현탁하고, 이 세포 현탁액 20 ml를 MS-5 세포와 배지 80 ml가 들어 있는 50개의 플라스크에 각각 분주하십시오. 주의: 이 단계에서 100ml의 적혈구계 세포가 0.3x10^6 cells/ml 농도로 포함되어 있으며 MS-5 세포가 합류(confluent) 상태인 플라스크 50개가 준비되어 있어야 합니다.6 cell/ml.
      9. trypsin 0.05% EDTA를 사용하여 나머지 MS-5 세포 11개 플라스크를 T-175 플라스크에 1:5 비율로 희석하여 배양 확장하십시오. 최종 세포 농도는 ~0.08x10⁶/mL가 되어야 합니다.6 cell/ml. 참고: ~0.08x10 밀도의 MS-5 세포가 담긴 플라스크 55개6 cell/ml로 준비해야 합니다.
    • 12일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 적혈구계 세포를 계수하여 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 세포 수(즉, 배양액 약 4ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 주의: 세포 밀도는 ~0.6x10^6 cells/mL가 되어야 합니다.6 cell/ml.
    • 14일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 적혈구계 세포를 계수하여 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 수의 세포(예: 배양액 ~3ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 참고: 세포 밀도는 ~0.9x10이어야 합니다.6 cell/ml.
  4. 단계 3: 15-18일차
    일부 세포는 향후 사용(예: 핵 추출)을 위해 수확합니다. 나머지 적혈구계 세포는 사이토카인이 포함되지 않은 보충 IMDM 배지 내의 MS-5 세포와 공배양합니다.
    • 15일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 적혈구계 세포를 계수하여 사멸 세포를 제외합니다. 참고: 세포 밀도는 약 1x10이어야 합니다.6 cell/ml.
      2. 1L의 1x PBS와 5L의 보충된 IMDM 배지(표 2)를 37°C에서 미리 데워 둔다.
      3. 10x10에 해당하는 부피의 배양액을 따로 보관하십시오.8 세포(예: 100ml 플라스크 약 10개)를 준비하고 e 단계로 진행한다.
      4. 남은 세포 (예: 40x10^5)8)을 수확하여 0.1mM DTT가 포함된 차가운 MS30 버퍼(표 5)에 재현탁하여 추후 사용을 위해 보관합니다(단계 2: 11일 차 d항 참조).
      5. 합류(confluence) 상태의 MS-5 세포가 담긴 플라스크 50개를 각각 20 ml의 1xPBS로 세척하고, 즉시 각 플라스크에 신선한 보충제 함유 IMDM 배지 80 ml를 첨가하십시오.
      6. 10x10에 해당하는 양을 원심분리하십시오.8 적혈구 세포를 원추형 튜브 4개에 넣고 450 g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거한다.
      7. 보충제가 첨가된 IMDM 배지 100ml를 사용하여 4개의 세포 펠렛을 각각 세척하십시오.
      8. 각 세포 펠렛을 보충제가 첨가된 IMDM 배지 250 ml에 재현탁하고, 이 세포 현탁액 20 ml를 MS-5 세포와 배지 80 ml가 들어 있는 50개의 플라스크 각각에 분배한다. 참고: 이 단계에서 0.2x10^6 cells/ml 농도의 적혈구계 세포 100ml가 포함된, MS-5 세포가 합류(confluent)된 플라스크 50개가 준비되어 있어야 합니다.6 cells/ml
      9. 0.05% EDTA가 포함된 trypsin을 사용하여 MS-5 세포가 담긴 나머지 5개의 플라스크를 T-175 플라스크에 1:5 비율로 희석하여 배양 확장하십시오. 최종 세포 농도는 약 0.08x10^6/mL가 되어야 합니다.6 cell/ml. 참고: 약 0.08x10^6 cells/mL 농도의 MS-5 세포가 담긴 플라스크 20개6 cell/ml로 준비해야 합니다. 남은 MS-5 세포는 동결하여 액체 질소에 보관하십시오.
    • 16일차:
      1. Trypan blue를 사용하여 적혈구계 세포를 계수하여 사멸 세포를 제외하고, 실험에 필요한 수의 세포(즉, 약 4 ml의 배양액)를 수확하십시오(단락 6 참조). 참고: 세포 밀도는 ~0.6x10^6 cells/mL이어야 합니다.6 cell/ml.
  5. 단계 4: 18~26일 차
    적혈구 세포를 3-4배 농축하여 5-7x106 cell/ml의 최종 농도로 조절하여 MS-5 층에서 유지하며 성숙을 유도한다. 배양 적혈구(cRBCs)를 더 잘 보존하기 위해 보충제가 첨가된 IMDM 배지에 10% FBS를 추가한다.
    • 18일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 적혈구계 세포를 계수하여 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 수의 세포(즉, 배양액 약 2ml)를 수확하십시오(6항 참조). 참고: 세포 밀도는 ~1.7x10^6/mL가 되어야 합니다.6 cell/ml.
      2. 1xPBS 300ml와 10% FBS가 포함된 보충 IMDM 배지 1.5L(표 2)를 37°C에서 예열한다.
      3. 합류(confluent) 상태의 MS-5 세포가 담긴 플라스크 15개를 각각 20ml의 1xPBS로 세척하고, 즉시 각 플라스크에 보충제가 첨가된 신선한 IMDM 배지 80ml를 추가한다.
      4. 적혈구 세포(즉, 85x10^6개에 해당하는 양)를 원심 분리합니다.8 세포)를 450 g에서 10분간 원심 분리한 후, 펠릿을 합쳐 4개의 원추형 튜브에 나누어 담습니다.
      5. 각 세포 펠릿을 10% FBS가 포함된 보충 IMDM 배지 75ml에 재현탁하고, 이 세포 현탁액 20ml를 MS-5 세포와 배지 80ml가 들어 있는 15개의 플라스크에 각각 분주하십시오. 참고: 이 단계에서 100ml의 적혈구 세포(6x10)를 포함하며 MS-5 세포가 합류(confluent)된 플라스크 15개가 준비되어 있어야 합니다.6 cell/ml.
      6. trypsin 0.05% EDTA를 사용하여 남은 5개의 MS-5 세포 플라스크를 T-175 플라스크에 1:5 비율로 희석하여 확장 배양하십시오. 최종 세포 농도는 ~0.08x10^6/ml가 되어야 합니다.6 cell/ml. 참고: 약 0.08x10^6 cells/mL 밀도의 MS-5 세포가 담긴 플라스크 20개6 cell/ml가 준비되어야 합니다. 남은 MS-5 세포는 동결하여 액체 질소에 보관하십시오.
    • 20일차:
      1. Trypan blue를 사용하여 적혈구계 세포 수를 측정하여 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 수의 세포(즉, 배양액 약 1.5 ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 참고: 세포 밀도는 ~1.5x10으로 유지합니다.6 cell/ml.
    • 22일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 적혈구계 세포를 계수하여 사멸 세포를 제외하고, 실험에 필요한 수의 세포(즉, 배양액 약 1.5 ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 참고: 세포 밀도는 ~1.5x10으로 유지됩니다.6 cell/ml.
      2. Day 18의 설명과 동일하게 배지를 교체하고 적혈구계 세포를 새로운 MS-5 세포 층으로 옮깁니다.
    • 24일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 적혈구계 세포를 계수함으로써 사멸 세포를 제외하고, 테스트에 필요한 수의 세포(즉, 배양액 약 1.5 ml)를 수확하십시오(문단 6 참조). 참고: 세포 밀도는 ~1.5x10으로 유지됩니다.6 cell/ml.
    • 26일 차:
      1. Trypan blue를 사용하여 적혈구계 세포를 계수하여 사멸 세포를 제외하고, 실험에 필요한 수의 세포(즉, 배양액 약 1.5 ml)를 수확하십시오(단락 6 참조). 참고: 세포 밀도는 약 1.5x10으로 유지됩니다.6 cell/ml.
      2. 비부착성 탈핵 및 완전 헤모글로빈화된 cRBC를 수확하십시오. 참고: 성숙한 cRBC는 SAGM 배지(MacoPharma)에서 4°C로 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.
  6. 시험 및 대표 결과
    세포 증식과 적혈구 분화가 적절히 이루어졌는지 확인하기 위해 지정된 일자에 다음 시험들을 수행합니다. 그림에 제시된 대표 결과는 CD34를 사용하여 얻은 것입니다.+ 백혈구 성분 채집술(leukapheresis)을 통해 분리된 세포.
    1. 세포 수는 이틀마다 측정합니다. 세포 증식의 대표적인 결과는 그림 2에서 확인하십시오.
    2. May-Grünwald Giemsa 형태학적 염색은 0.05 x 10을 사용하여 이틀마다 수행합니다.6 0일차부터 8일차까지의 세포 및 0.2x106 Giemsa 염색 제조사의 지침(표 1)에 따라 나머지 날짜의 세포들을 처리하십시오. 대표적인 결과는 그림 3에서 확인하십시오.
    3. 반고체 배양 분석은 0일부터 12일까지 이틀 간격으로 0.01x10^6개의 세포를 사용하여 조혈모세포를 측정하기 위해 두 번씩 반복 수행됩니다.6 Methocult 반고체 배지 제조사의 지침(표 1)에 따라 분석당 세포 수를 설정하십시오. 대표적인 결과는 그림 4에서 확인할 수 있습니다.
    4. 다음 세포 마커들에 대한 분석을 FACS를 이용하여 격일로 수행합니다: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS (0.2 x10^6 세포 사용)6 어세이당 세포 수. 그림 5의 대표적인 결과를 참조하십시오.
    5. 헤모글로빈은 이틀마다 벤지딘 염색법으로 측정하였습니다. 대표적인 결과는 그림 5를 참조하십시오.
    6. 유전자 발현은 1x10^6개의 세포에서 RNA를 추출한 후 RT-qPCR 또는 마이크로어레이(microarray)를 통해 분석합니다.6 세포. 대표적인 결과는 그림 6B에서 확인하십시오.

결과에 대한 설명:

그림 1은 인간 CD34+ 세포를 성숙한 헤모글로빈 함유 적혈구로 ex vivo 분화시키는 프로토콜을 보여줍니다. 적혈구 분화 과정에서 세포는 매우 활발하게 증식하며, 이는 성분채집술(leukapheresis)로 분리한 CD34+ 세포를 사용하여 얻은 그림 2의 약 8,000배 증폭 결과에서 확인할 수 있습니다. 골수에서 분리한 CD34+ 세포는 약 6,000배 증폭으로 증식력이 약간 더 낮으며, 제대혈에서 분리한 CD34+ 세포는 50,000배 증폭까지 도달할 수 있습니다. 분화의 특정 단계에 있는 세포들은 그림 3에 나타난 것과 같이 식별 가능한 크기와 형태를 보입니다. 20일째부터 분화 마지막 단계에서 일어나는 탈핵 과정을 확인하십시오. 26일째가 되면 모든 세포의 핵이 소실됩니다 (그림 3).

그림 4에 제시된 군락 형성 분석(Colony forming assays)은 분화 초기 단계(0일 차부터 8일 차까지) 동안 초기 및 후기 조혈 전구세포를 검출하는 데 사용됩니다. 적혈구 전구세포(CFU-E 및 BFU-E) 외에도, 0일 차의 초기 CD34+ 세포 내에는 과립구-대식세포 전구세포(CFU-GM)가 상당 부분 존재함을 알 수 있습니다. 분화가 진행됨에 따라 CFU-GM은 현저히 감소하며, 6일 차에는 적혈구 전구세포인 BFU-E와 CFU-E로 완전히 대체됩니다. 또한 4일 차부터 6일 차 사이에 초기 적혈구 전구세포인 BFU-E가 더 분화된 형태인 CFU-E로 점진적으로 대체된다는 점이 중요합니다. 10일 차가 되면 적혈구 세포는 기본적으로 군락 형성 능력을 상실하게 됩니다.

마지막으로, 그림 5에 나타난 바와 같이 세포 표면 마커의 발현을 통해 적혈구 생성 과정을 모니터링합니다. 다음 사항에 유의하십시오: 1) 조혈 줄기/전구세포 마커인 CD34의 점진적인 소실; 2) 전구세포 마커인 CD36의 점진적인 획득 및 소실; 3) 적혈구 전구세포 및 망상적혈구 마커인 CD71의 점진적인 획득 및 소실; 4) 적혈구 전구체 및 적혈구 마커인 GPA의 증가. 적혈구 분화의 다른 마커로는 8일차부터 시작되는 헤모글로빈 합성(벤지딘 염색으로 측정-그림 5)과 DNA 염색제 LDS의 소실로 측정되는 20일차부터의 세포 핵 제거(그림 5)가 있습니다. 마지막으로, 전사 인자인 TAL1(그림 6B) 또는 β-globin 유전자(데이터 미제시)와 같은 분자 마커의 RT-qPCR을 통해 적혈구 분화를 측정할 수 있습니다.

일반적으로 제대혈 / 백혈구 성분 채집술 / 골수 1 ml당 0.35x105 / 0.5x105 / 1.1x105 CD34+ 세포가 제공되며, 이는 각각 50,000 / 8,000 / 6,000의 증식률로 이론적으로 1.7x109 / 0.4x109 / 0.7x109 개의 적혈구를 생성할 수 있습니다. 분화 과정 끝에 50x106 개의 적혈구를 얻으려면 약 50 ml의 배양이 필요합니다.

파트 II. ex vivo 적혈구 분화 과정 중 렌티바이러스 매개 넉다운

렌티바이러스(Lentivirus)는 인간 일차 세포의 유전자 전달을 위해 선택되는 도구입니다 (예: Amsellem et al. 9 참조). 렌티바이러스는 표적 shRNA를 전달하여 일차 세포 내의 표적 유전자를 넉다운(knockdown)시키는 데 자주 사용됩니다 (예: Laurenti et al. 10 참조). 본 프로토콜에서는 인간 일차 적혈구 세포의 전사 인자인 TAL1을 표적으로 합니다. 알려진 어떤 유전자와도 일치하지 않는 스크램블(scrambled) 서열의 shRNA를 음성 대조군으로 사용합니다. 형질전환 효율을 평가하기 위해 GFP 발현을 이용합니다.

1. 렌티바이러스 벡터 입자의 준비

렌티바이러스 입자를 얻기 위해, 인간 배아 신장 293T 세포에 세 가지 플라스미드를 공동 형질전환합니다. 하나는 env, vpr, vif, vpu 및 nef를 제외한 HIV-1 유전자를 코딩하는 2세대 바이러스 패키징 시스템(즉, psPAX2)이며, 다른 하나는 수포성 구내염 G-가성형 바이러스의 외피를 코딩하는 플라스미드(즉, pMD2G)이고, 마지막 하나는 목적 유전자를 코딩하는 렌티바이러스 벡터(즉, TAL1 shRNA를 코딩하는 pBLOCK-it6-DEST(shTal1), scrambled shRNA를 코딩하는 pBLOCK-it6-DEST(shScr) 또는 GFP를 코딩하는 pWPIP)입니다(표 4). 렌티바이러스 입자는 형질전환된 293T 세포의 세포 배양 상층액에서 수집합니다.

세포의 원치 않는 감염을 방지하기 위해, 모든 렌티바이러스 실험(바이러스 준비 및 감염)은 다른 세포 배양과 분리된 전용 후드 내에서 수행합니다. 또한, 렌티바이러스로 인해 발생한 폐기물은 별도로 폐기합니다. 본 프로토콜에 기술된 2세대 렌티바이러스는 복제 불능이며 생물안전등급 2(Biosafety Level 2) 생물체로 취급해야 합니다. 일부 기관에서는 렌티바이러스와 관련하여 특정 안전 절차를 두고 있을 수 있으므로, 해당 기관의 기설정된 가이드라인을 따를 것을 권장합니다.

본 프로토콜에서는 분화의 어느 단계에서든 1~2백만 개의 일차 적혈구 세포를 감염시키기에 충분한 렌티바이러스 입자를 생성하는 방법을 설명합니다. 규모를 확대하거나 축소할 때는 그에 맞게 부피를 조정해야 합니다. 시약은 표 4와 5를 참조하십시오.

  1. 인산칼슘을 이용한 293T 세포의 형질전환
    1. 형질전환 하루 전, 10% FBS와 Pen/Strep가 포함된 20 ml의 DMEM/High glucose 배지에 13.2 x 106 개의 293T 세포를 15-cm 세포 배양 접시에 분주한다. 주의: 이를 통해 형질전환 당일에 세포 합유도(confluency)가 70%에 도달하게 해야 한다. 낮은 계대(<20)의 293T 세포를 사용할 때 최상의 결과를 얻을 수 있다.
      선택 사항: 293T 세포의 부착력을 높이기 위해 접시를 type I collagen 또는 Poly-L-lysine으로 코팅할 수 있다.
    2. 형질전환 2시간 전, 293T 세포의 배지를 흡입하여 제거하고 37°C로 예열한 신선한 배지 20 ml를 조심스럽게 첨가한다. 주의: 일반적으로 일과 종료 시점에 형질전환을 시작한다.
    3. 5 ml 튜브에 다음 시약들을 혼합한다:
      • 관심 유전자의 발현 벡터 44.8 μg (예: shRNA 또는 GFP-표 4 참조)
      • pMD2.G 외피 벡터(envelope vector) 13.35 μg
      • psPAX2 패키징 벡터(packaging vector) 33.48 μg
      • 멸균된 H2O를 충분히 넣어 최종 부피를 1.116 ml로 맞춘다.
    4. 멸균된 H2O를 충분히 넣어 최종 부피를 1.116 ml로 맞춘다.
    5. 2.5M CaCl2 109.8 μl를 첨가하고 볼텍싱하여 혼합한다.
    6. 50 ml 원추형 튜브에 2xHBS 버퍼(표 5) 1.116 ml를 넣는다.
    7. 지속적으로 볼텍싱하며 DNA 혼합액을 2xHBS 버퍼에 한 방울씩 첨가한다.
    8. 상온(RT)에서 20분 동안 침전물이 형성되도록 둔다. (최대 30분을 넘기지 않는다).
    9. 2.3 ml의 용액을 293T 세포가 담긴 접시에 한 방울씩 첨가하고, 가볍게 흔들어 섞은 후 37°C 배양기에 12-14시간 동안 보관한다.
    10. 다음 날 이른 아침에 배지를 흡입하여 제거하고 37°C로 예열한 신선한 배지 20 ml로 교체한다.
  2. 렌티바이러스 수확 및 농축
    1. 형질전환 48시간 후, 렌티바이러스가 포함된 배지 20 ml를 수확하여 50 ml 원추형 튜브에 담는다.
    2. 293T 세포에 37°C로 예열한 배지 20 ml를 추가하고 다시 배양기로 옮긴다.
    3. 바이러스 상청액을 450 g에서 10분간 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 새 50 ml 튜브로 옮긴다. 또는 상청액을 0.45μm 필터로 여과할 수 있다. 정제된 상청액은 4°C에 보관한다.
    4. 24시간 후, 나머지 배지 20 ml를 수확한다. 주의: 두 번의 수확에서 바이러스 역가가 대략 동일함(즉, 1x 106 TU/ml)을 확인하였다.
    5. 바이러스를 농축하기 위해, 바이러스 상청액을 Beckman OptiSeal 튜브에 나누어 담고(튜브당 상청액 32.4 ml 사용), 스윙 로터를 사용하여 4°C에서 100,000g으로 1.5시간 동안 원심분리한다. 주의: 바이러스 상청액을 농축하는 다른 방법으로는 47,000 g에서 2시간 또는 3,000 g에서 8시간 동안 원심분리하는 방법이 있다. 농축 전에는 바이러스를 냉동하지 마십시오. 냉동하면 단백질이 침전되어 바이러스 재현탁이 어려워진다.
    6. 초원심분리 직후, 10 ml 플라스틱 피펫을 사용하여 상청액을 천천히 흡입하여 제거한다. 주의: 튜브에서 쉽게 떨어질 수 있는 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의한다. 상청액의 처음 5ml를 제거한 후, 일반적으로 초원심분리 튜브의 윗부분을 잘라 상청액을 최대한 제거한다. 즉, 튜브 바닥에 배지를 약 100-200 μl만 남긴다.
    7. 1xPBS 100 μl를 첨가하고 상온(RT)에서 30분 동안 펠릿을 녹인 후, 피펫팅을 15-20회 반복하여 재현탁한다. 주의: 일반적으로 약 200-300 μl의 농축 바이러스를 얻는다.
    8. 농축된 렌티바이러스 조제물은 Invitrogen의 프로토콜(Block-it lentiviral RNAi Expression System)을 사용하여 NIH3T3 세포에서 역가를 측정한다. 주의: 일반적으로 2 내지 10x108 transducing units (TU)/ml의 바이러스 역가를 얻는다.
    9. 이제 바이러스를 감염에 사용하거나(단락 2 참조), 소분하여 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있다. 주의: 바이러스 현탁액을 한 번 이상의 동결-해동 사이클에 노출시키지 마십시오. 바이러스는 37°C에서 4-5시간, 상온(RT)에서 2-3일, 또는 4°C에서 일주일 동안 안정적이다.

2. 유전자 전달을 위한 일차 적혈구 세포의 렌티바이러스 감염

  1. 감염
    핵이 있는 적혈구계 세포는 50-100의 높은 MOI(감염 다중도)를 사용하는 한 분화의 어느 단계에서든 효율적으로 감염될 수 있습니다. 여기서는 TAL1 또는 scramble shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 사용하여 분화 8일 차와 9일 차의 적혈구계 세포를 50 TU/cell의 MOI로 감염시키는 전형적인 실험을 설명합니다. 24시간마다 RNA를 추출하여 RT-qPCR로 TAL1 KD 수준을 확인합니다. 감염 효율을 평가하기 위해 FACS로 GFP 발현을 병행하여 측정합니다(그림 6의 대표 결과 참조).
    • 0일 차:
      1. 각각 1x106개의 적혈구계 세포를 포함하는 15 ml 원추형 튜브 3개를 준비합니다(즉, TAL1 넉다운용 튜브 1개, scrambled 음성 대조군용 튜브 1개, GFP 발현 대조군용 튜브 1개).
      2. SCF와 EPO가 포함된 보충 IMDM 배지 5 ml로 세포를 세척하고(Part I 참조), 200 g에서 5분간 원심 분리한 후 가능한 한 많은 상층액을 제거합니다.
      3. 농축된 바이러스 용액에 최종 농도가 40 μg/ml가 되도록 polybrene(표 4)을 첨가합니다.
      4. polybrene이 포함된 농축 바이러스 100 μl(즉, 5x107 TU)를 각 적혈구계 세포 튜브에 첨가합니다.
      5. 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하며 10분마다 핑거 태핑으로 섞어줍니다. 참고: 렌티바이러스가 세포에 최대한 흡착될 수 있도록 최소량의 배지에서 감염을 수행해야 합니다. 또한, 10분마다 섞어주면 세포 전체에 바이러스가 고르게 분포됩니다.
      6. 각 튜브에 SCF와 EPO가 포함된 보충 IMDM 배지 900 μl(표 2 및 3)를 첨가합니다.
      7. 각 샘플을 6-well 플레이트로 옮기고 37°C 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
    • 1일 차: 세포를 별도의 15 ml 튜브에 수확하고, 200 g에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 후 감염 과정을 반복합니다(위의 b~g 단계).
    • 2일 차: 세포를 세척하고 SCF와 EPO가 포함된 보충 IMDM에 0.2x106 cell/ml 농도로 재부유시킨 후 Part I과 같이 진행합니다.
  2. 대표 결과
    그림 6A는 일차 적혈구계 세포의 렌티바이러스 감염 후 RNA 추출 프로토콜을 보여줍니다. 한 실험에서 우리는 전사 인자인 TAL1을 표적으로 하는 shRNA 또는 scrambled 대조군을 생성하는 렌티바이러스로 적혈구계 세포를 감염시켰습니다11. 그림 6B는 일차 적혈구계 세포에서 TAL1 전사체의 75%를 넉다운시키는 데 성공했음을 보여줍니다. 또한, scrambled 대조군에서 9일 차부터 12일 차까지 TAL1 전사체 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있는데, 이는 적혈구 분화 과정에서 이 전사 인자가 중요함을 뒷받침합니다. 또 다른 실험에서는 GFP 단백질을 발현하는 렌티바이러스로 적혈구계 세포를 감염시켰습니다. 그림 6C는 감염 3일 후, 현미경 하의 형광 측정 및 FACS 측정 결과 대부분의 적혈구계 세포(87%)가 GFP를 발현하고 있음을 보여줍니다. 이는 일차 적혈구계 세포에서 높은 감염 효율을 나타냅니다. 우리는 이전에 CD34+ 세포를 0일 차에 비슷한 효율로 감염시킨 바 있습니다(데이터 미제시). 일차 세포의 효율적인 형질전환을 위한 가장 중요한 파라미터는 높은 MOI(즉, 농축된 렌티바이러스)를 사용하는 것입니다. 낮은 MOI(즉, 비농축 바이러스)를 사용하면 형질전환 효율이 감소합니다.

3. 대표 결과

CD34+ HSCs 양성 분리 도식; 면역자기 분리, 무혈청 적혈구 분화
그림 1. 인간 일차 조혈모/전구세포의 분리 및 ex vivo 적혈구 분화를 위한 프로토콜 개요. (Step1) 양성 면역자기 선택법을 사용하여 탯줄혈, 골수 또는 G-CSF로 동원된 인간 말초혈(백혈구 성분 채집술)로부터 CD34+ 세포(순도 95 ± 3%)를 분리합니다. (Step2) 분리된 CD34+ 세포는 명시된 4단계 프로토콜에 따라 액체 배양으로 배양합니다.

세포 증폭 그래프; 로그 스케일; 배양 일수 대비 세포 성장 경향 분석.
그림 2. ex vivo 적혈구 분화 프로토콜 동안의 세포 증폭. 결과는 로그 스케일로 표시되었다. 백혈구 성분 채집술로 분리한 CD34+ 세포를 통해 얻은 대표적인 결과이다.

적혈구 생성 단계 도표, 26일간의 적혈구 발달 과정을 추적한 현미경 이미지.
그림 3. ex vivo 적혈구 분화 과정 중 세포 형태 분석. 분화 과정의 표시된 시점에서 세포를 May-Grünwald-Giemsa 시약으로 염색하였다(배율 x 40). HSC: 조혈줄기/전구세포; BFU-E: 적혈구계 형성단위-돌출형; CFU-E: 적혈구계 형성단위-집락형; Pro EB: 전적혈모구; Baso EB: 염기성 적혈모구; Poly EB: 다염성 적혈모구; Ortho EB: 정염성 적혈모구; RET: 망상적혈구; RBC: 적혈구.

반고체 분석 차트; 전구세포 성장 CFU-GM, BFU-E, CFU-E; 세포 배양 일수; 이미지 비교.
그림 4. 조혈 전구세포를 검출하고 정량화하기 위한 콜로니 형성 세포(CFC) 분석. 표시된 시점에서, 적혈구계 전구세포(BFU-E 및 CFU-E)와 과립구-대식세포 전구세포(CFU-GM)의 최적 성장을 지원하기 위해 rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO 등의 재조합 인간 사이토카인이 포함된 반고체 메틸셀룰로오스 배지에 104개의 세포를 접종하였다. BFU: burst forming units; CFU: colony forming units. BFU-E 및 CFU-E의 전형적인 사진도 함께 제시되었다. BFU-E와 CFU-E의 헤모글로빈화로 인해 나타나는 적갈색에 유의하라.

시간 경과에 따른 세포 마커 CD34, CD36, CD71, GPA, Benzidine, LDS를 보여주는 조혈 분화 그래프.
그림 5. ex vivo 적혈구 분화 과정 중 조혈/적혈구 마커의 역학. 표시된 시점에서 2x105개의 세포를 수확하여 FACS(CD34, CD36, CD71, GPA 및 LDS) 또는 현미경(Benzidine)으로 표시된 마커의 발현을 분석하였다. 막대는 양성 세포의 백분율을 나타낸다. CD34: 인간 조혈 줄기/전구 세포에 존재하는 transmembrane glycoprotein; CD36: 전구 세포에 존재하는 thrombospondin receptor; CD71: 적혈구 전구 세포 및 망상적혈구에 존재하는 transferrin receptor; GPA: 적혈구 전구체 및 적혈구에 존재하는 glycophorin A; Benzidine: 헤모글로빈 염색; LDS: laser dye styryl, DNA 염색.

렌티바이러스 shRNA 감염 타임라인, TAL1 mRNA 발현 막대 그래프, GFP 현미경 사진, 유세포 분석.
그림 6. 인간 일차 전적모세포에서의 렌티바이러스 매개 유전자 전달. (A) 렌티바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 일차 전적모세포 내 TAL1 넉다운(KD) 유도 타임라인. (B) TAL1 넉다운은 렌티바이러스로 전달된 anti-Tal1 shRNA (TAL1 KD) 또는 스크램블 대조군 shRNA (Scr)에 의해 매개되었다. TAL1 mRNA 전사체 수준의 역학은 RT-qPCR로 측정하였다. TAL1 전사체는 18S RNA 대비 상대적인 발현량으로 표시하였다. (C) 렌티바이러스로 전달된 GFP는 현미경(왼쪽 패널) 또는 FACS(오른쪽 패널)로 확인하였다. 세포의 87%가 GFP 양성이었다.

4. 재료

시약제조사카탈로그 번호
RPMI 1640 SigmaR8758
Collagenase BRoche Applied Science11088807001
DNase ISigmaD5025-15KU
분리 전 필터 (30μm 나일론 메쉬)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x 적혈구 용해 버퍼StemCell Technologies20120
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec Inc130-046-703
LS Mini-Macs 컬럼Miltenyi Biotec Inc130-042-401
autoMACS Running Buffer-MACS Separation BufferMiltenyi Biotec Inc130-091-221
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec Inc130-042-102
마우스 골수 기질 세포 MS-5 (마이코플라스마 오염 여부 정기적 테스트 필요)DSMZACC 441
Trypan Blue 용액 (0.4%)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Trypsin 0.05%/EDTAThermoScientific J101521
May Grunwald Giemsa Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
인체 세포용 Methocult 콜로니 형성 세포 (CFC) 분석 키트 StemCell Technologies 04044

표 1.

성분스톡 용액부피 600 ml
IMDMSigma I3390443.4 ml
Pen/Strept 1% (vol/vol)Gibco 103786ml
L-glutamine 4x10-3M200mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40μg/ml4mg/ml (Sigma I5125)
제조 방법 : 분말 28 mg을 IMDM 7 ml에 녹인 후 필터 멸균한다. 4°C에서 1주일간 안정적이다.		6ml
Folic acid 10μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
제조 방법 : 분말 7 mg을 미리 데운 IMDM 7 ml에 녹인 후 필터 멸균한다. 4°C에서 1주일간 안정적이다. 사용 전 미리 데워 사용한다.		6ml
Monothioglycerol 1.6x10-4M0.16M (Sigma M6145)
제조 방법 : 11.56M 스톡 용액 10 μl를 IMDM 712 μl에 녹인 후 필터 멸균한다. 4°C에서 1주일간 안정적이다.		0.6ml
Ferrous nitrate 90 ng/ml18μg/ml ( Sigma 8508)
제조 방법 : 1.8 mg을 증류수 1ml에 녹인다. 이 용액 0.1 ml를 취해 IMDM 9.9 ml를 추가하고 필터 멸균한다. 4°C에서 1주일간 안정적이다.		3ml
Ferrous sulfate 900 ng/ml180 μg/ml ( Sigma F8633)
제조 방법 : 18 mg을 증류수 1ml에 녹인다. 이 용액 0.1 ml를 취해 IMDM 9.9 ml를 추가하고 필터 멸균한다. 4°C에서 1주일간 안정적이다.		3ml
Bovine serum albumine-Insulin-Transferrin (BIT)
20% (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

표 2.

성분스톡 용액보충된 IMDM 100 ml에 첨가할 부피 (표 2)
Hydrocortisone (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
제조 방법: 분말 5mg을 IMDM 1.03ml에 녹인다. 0.1 ml를 취해 IMDM 9.9 ml를 더하고 여과 멸균한다. 4°C에서 1주간 안정적이다. 		1ml
Stem Cell Factor (SCF) 100ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
제조 방법: 분말 50 μg을 PBS+0.1% BSA 500 μl에 녹이고 여과 멸균한다. 100 μl씩 소분하여 -20°C에 보관한다.		100 μl
Erythropoietin (EPO) 3 IU/ml12,000UI/ml에 해당하는 100 μg/ml (Feldan FB03-10-290)
제조 방법: 분말 50 μg을 PBS+0.1% BSA 500 ml에 녹이고 여과 멸균한다. 25 ml씩 소분하여 -20°C에 보관한다.		25 μl
Interleukin 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
제조 방법: 분말 10 μg을 PBS+0.1% BSA 100 μl에 녹이고 여과 멸균한다. 5 ml씩 소분하여 -20°C에 보관한다.		5 μl

표 3.

시약공급처참고문헌
293T 세포
(정기적으로 마이코플라즈마 오염 여부 테스트 수행) 		ATCCCRL-11268
DMEM/High GlucoseThermoScientificSH30243.01
Hexadimethrine bromide (Polybrene)SigmaH9268-5G
OptiSeal 초원심분리 튜브Beckman Coulter361625
psPAX2 플라스미드Addgene (D. Trono 연구실)12260
pMD2.G 플라스미드Addgene (D. Trono 연구실)12259
pBLOCK-it6-DEST (shTal1) 플라스미드Invitrogen의 pBLOCK-it6-DEST 플라스미드에 클로닝된 Tal1 shRNA 서열Palii et al. EMBO J.
pBLOCK-it6-DEST (shScr) 플라스미드Invitrogen의 pBLOCK-it6-DEST 플라스미드에 클로닝된 Scrambled shRNA 서열Palii et al. EMBO J.
pWPI 플라스미드Addgene (D. Trono 연구실)12254

표 4.

완충액조제 방법최종 농도
2xHBS
  • 1.6 g NaCl
  • 1.3 g HEPES
  • 0.04 g Na2HPO4(7H2O)
  • Milli-Q 물을 추가한다.
  • NaOH 용액을 첨가하여 pH를 정확히 7.11-7.13으로 조절하고 Milli-Q 물을 채워 100 ml로 맞춘다.
  • pH를 7.11-7.13으로 미세 조정한다.
  • 필터 멸균 후 10 ml씩 분주하여 -200C에 보관한다.
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g 무수 CaCl2
  • 10 ml Milli-Q 물에 녹인다.
  • 필터 멸균 후 1 ml씩 분주하여 -20°C에 보관한다.
  • 2.5M
MS30
  • [2M] Tris pH8.0 25ml
  • [0.5M] EDTA 5ml
  • Glycerol 300ml
  • 50mM
  • 2.5mM
  • 30% (v/v)

표 5.

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토론

방법 번호는 성공의 변수 정도로 문화에 erythroid 세포를 차별화하기 위해 이전에 사용되었습니다. 예를 들어, MS - 5 공동 문화없이는 어떤 프로토콜 erythroid 세포의 확장을 허용했지만 12-17 완전히 성숙 enucleated 적혈구를 생산 효율이되지 않습니다. 다른 방법은 효율적인 핵의 제거를 허용하는 동안, 그것은 확산 18,19의 비용입니다. 우리가 처음 도이 실험실 6 발전, 여기서 사용한 방법은, (게놈과 proteomics 연구에 필요한) erythroid 차별의 초기 단계 동안 세포 증폭을 연장하기 때문에 초기 progenitors 다수의 우리에게 제공하는 최초의 액체 문화 단계를 결합 하고, 헤모글로빈 합성을 극대화하고 적혈구의 완전한 핵의 제거를 얻는 것이 중요합니다 MS - 5 mesenchymal 세포에 공동 문화의 두 번째 단계. 우리의 방법의 두 가지 제한이 지금까지 완전히 단백질 수준과이 프로토콜을 수행 2) 높은 가격에서 매...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 혈액 샘플을 (오타와 병원 연구 윤리위원회에 따라 얻은 제공을위한 전 생체내 erythroid 차별, D. 앨런과 H. 앳킨스 (오흐르지, 캐나다)에 대한 조언 L. 도이와 MC Giarratana을 (Université 파리 VI, 프랑스) 감사 # 2007804 - 01H), D. Trono (이콜 Polytechnique Fédérale 호텔 드 로잔) 비판적 원고를 읽기위한 lentiviral 벡터와 FJ 딜워쓰을 (오흐르지, 캐나다) 제공. 이 프로젝트는 MBCGP에 CIHR 부여 (걸레 - 82813)에 의해 재정 지원되었다 온타리오 연구 기금 전산 Regulomics 교육 박사 과정 이수 해안받는 사람입니다. MB의 유전자 발현의 규정에 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다.

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참고문헌

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  21. Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).

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