예 생체내 프로토콜 설명 조혈 줄기 / progenitors에서 성숙한 인간의 적혈구를 생성합니다. 또한 우리는 최저 기본 erythroid 세포에 전사 인자의 TAL1를 효율적 lentiviral 배달 방법을 설명합니다. lentivirus 매개 유전자 전달의 효율성은 GFP 표현 바이러스를 사용하여 증명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
적혈구 조혈은 세포 분화 연구를 일반적으로 사용되는 모델 시스템입니다. 적혈구 조혈 동안, pluripotent 성인 인간의 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 oligopotent progenitors, 헌신 엽 성의 전구 물질과 성숙 적혈구 1로 구분. concomitantly 다른 세포 유형 2와 관련된 유전자를 억압하는 동안이 과정은 구체적인 전사 요소 혈통 특정 유전자를 활성화 의하여 유전자 발현의 수준에서 큰 부분을 규제합니다. 적혈구 조혈을 조절 전사 요인에 연구는 종종 분화 3-5의 주어진 단계에, 어느 정도, erythroid 세포를 나타내는 인간과 murine 세포 라인을 사용하여 수행됩니다. 그러나 변형 세포 라인은 부분적으로만 erythroid 세포를 모방 수 있으며 가장 중요한 그들은 하나가 comprehensibly 최종 erythroid 운명을 향해 여러 단계를 통해 세포의 진행으로 발생하는 역동적인 변화를 연구하는 것을 허용하지 않습니다. 따라서, 현재의 과제는 게놈과 proteomics 실험을 수행하기 위해 충분 수량 분화의 여러 단계에서 기본 HSCs과 erythroid 세포의 비교적 동질적인 인구를 얻을 수있는 프로토콜의 개발 남아 있습니다.
여기 우리는 코드 혈액, 골수, 또는 G - CSF (leukapheresis)을 동원 성인 말초 혈액 중의 고립되었습니다 인간의 조혈 줄기 / 전구 세포에서 erythroid 분화를 유도하기 위해 전직 생체내 세포 문화 프로토콜을 설명합니다. 처음 도이 실험실 6 개발한이 시스템은 문화, 골수 microenvironment을 모방하기 위해 mesenchymal 세포에 크린 시토킨 및 공동 문화를 사용합니다. 이 전 생체내 차별 프로토콜을 사용하여, 우리는 erythroid progenitors의, 독점적 erythroid의 혈통과 enucleated 적혈구의 무대에 완전한 성숙을 향해 분화의 유도의 강력한 증폭을 관찰합니다. 따라서,이 시스템은 erythroid의 혈통을 따라 조혈 줄기 세포의 진전으로 transcriptional 규제의 분자 메커니즘을 연구하는 기회를 제공합니다.
transcriptional 수준에서 적혈구 조혈을 공부하면 기본 erythroid 세포의 이상 - 명시적 또는 최저의 특정 요소 수있는 능력이 필요합니다. 이러한 목적을 위해, 우리는 분리와 비 분리 전지 7 모두의 효율적인 감염을 허용 lentivirus - 중재 유전자 전달 시스템을 사용합니다. 여기서 우리는 효율적으로 기본 인간 erythroid 세포에 전사 인자의 TAL1을 최저 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 또한, GFP의 표현이 90 % 가까이 lentiviral 감염의 효율성을 보여줍니다. 따라서, 우리의 프로토콜은 규제 전사 요소의 네트워크 제어하는 적혈구 조혈의 특성화를위한 매우 유용한 기능을 제공합니다.
프로토콜
파트 I. 인간 조혈모/전구세포의 ex vivo 적혈구 생성
1. CD34+ 인간 조혈모/전구세포의 분리
조혈모세포(HSCs)와 초기 전구세포가 혼합되어 있는 인간 CD34+ 세포군8은 제대혈, G-CSF로 동원된 말초혈액(백혈구 성분 채집술) 또는 골수에서 수집합니다(그림 1-Step1). 제대혈이나 말초혈액을 사용하는 경우, 단계 1.2로 바로 진행하십시오. 골수를 사용하는 경우, 단계 1.1부터 시작하십시오. 시약 및 장비는 표 1을 참조하십시오.
별도로 명시되지 않는 한, 이 단계는 멸균 조건(즉, 후드 내) 및 RT에서 수행됩니다.
- 골수 단일 세포 현탁액 준비:
- 0.02% collagenase B와 100 U/ml DNase 1이 포함된 RPMI 1640 10배 부피로 골수를 재현탁하십시오.
- 밸런스 쉐이커에서 45분 동안 부드럽게 혼합하십시오.
- 세포를 30μm 나일론 메쉬로 여과하십시오.
- Ficoll 밀도 ....
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토론
방법 번호는 성공의 변수 정도로 문화에 erythroid 세포를 차별화하기 위해 이전에 사용되었습니다. 예를 들어, MS - 5 공동 문화없이는 어떤 프로토콜 erythroid 세포의 확장을 허용했지만 12-17 완전히 성숙 enucleated 적혈구를 생산 효율이되지 않습니다. 다른 방법은 효율적인 핵의 제거를 허용하는 동안, 그것은 확산 18,19의 비용입니다. 우리가 처음 도이 실험실 6 발전, 여기서 사용한 방법은, (게놈과 proteomics 연구에 필요한) erythroid 차별의 초기 단계 동안 세포 증폭을 연장하기 때문에 초기 progenitors 다수의 우리에게 제공하는 최초의 액체 문화 단계를 결합 하고, 헤모글로빈 합성을 극대화하고 적혈구의 완전한 핵의 제거를 얻는 것이 중요합니다 MS - 5 mesenchymal 세포에 공동 문화의 두 번째 단계. 우리의 방법의 두 가지 제한이 지금까지 완전히 단백질 수준과이 프로토콜을 수행 2) 높은 가격에서 매.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 혈액 샘플을 (오타와 병원 연구 윤리위원회에 따라 얻은 제공을위한 전 생체내 erythroid 차별, D. 앨런과 H. 앳킨스 (오흐르지, 캐나다)에 대한 조언 L. 도이와 MC Giarratana을 (Université 파리 VI, 프랑스) 감사 # 2007804 - 01H), D. Trono (이콜 Polytechnique Fédérale 호텔 드 로잔) 비판적 원고를 읽기위한 lentiviral 벡터와 FJ 딜워쓰을 (오흐르지, 캐나다) 제공. 이 프로젝트는 MBCGP에 CIHR 부여 (걸레 - 82813)에 의해 재정 지원되었다 온타리오 연구 기금 전산 Regulomics 교육 박사 과정 이수 해안받는 사람입니다. MB의 유전자 발현의 규정에 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다.
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참고문헌
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
- Friend, C., ....
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