Lentiviruses는 유전자 기능을 탐험을위한 가치있는 연구 도구되지만, 연구진은 알려진 pantropic lentivirus 인코딩이나 의심 oncogenes의 생산을 방지하실 수 있습니다. 대안으로, 우리는 ecotropic 수용체 mSlc7a1을 표현하는 수정된 인간의 세포에 ecotropic lentivirus의 사용을 위해 안전한 프로토콜을 제시한다.
방법 논문
향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입
이 논문에서
요약
초록
줄기 세포 및 종양 생물학 연구는 종종 실험실 직원에 대한 주요 안전 문제를 제기, 알려진 또는 의심되는 oncogenes와 인간 세포의 바이러스 전달을 필요로합니다. 등 일반적으로 사용되는 VSV - G pseudotype로 Pantropic lentiviruses는, 그들이 아닌 나누어 세포를 포함하여 많은 세포 유형을 transduce 수 있기 때문에 유전자 기능을 연구를위한 유용한 도구입니다. 그러나, 연구자들은 높은 biosafety 수준의 처리 요구 사항 및 안전 문제로 인해 oncogenes을 인코딩 pantropic 바이러스의 생산과 원심 분리를 방지하실 수 있습니다. C - Myc 및 SV40 큰 T 항원을 포함한 여러 적정량 oncogenes은, 유도 pluripotent 줄기 세포 (iPSC)의 생산을 강화하는 것으로 알려져 있습니다. 다른 모든 알려진 iPSC - 유도 유전자 변화 (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, 그리고 함수의 p53의 손실)도뿐만 아니라 상대적으로 높은 안전 우려를 제작, 암로 연결되는 링크를 제공하고 있습니다.
이러한 암 관련 바이러스가 세포 프로그래밍 및 pluripotency 공부에 도움이되지만, 그들은 안전하게 사용해야합니다. 이러한 biosafety 문제를 해결하기 위해, 우리는 감소 비용과 편리한 처리에 대한 자세한 중심으로, ecotropic lentivirus와 인간 세포의 형질 도입에 대한 방법을 보여줍니다. 우리는보다 90 % 이상 transduce 충분히 높은 titer와 ecotropic lentivirus을 생산해야 수용체를 표현하는이 방법의 효능을 확인, 바이러스에 노출된 인간의 세포를.
Lentivirus은 종종 ultracentrifugation에 의해 집중되어 있으나,이 과정은 몇 시간 걸립니다 인간의 생명 의학 연구에 전염성 에어로졸을 생성하실 수 있습니다. 대안, 바이러스 입자는보다 안전 콘드로이틴 황산 및 polybrene (CS / PB)와 complexation하여 세포에 sedimented 수 있듯이. 이 기술은 안정 무시할 추가 시간과 비용, murine 레트로 바이러스의 수용체를 표현 세포 3 배에 기능 바이러스 titer를 증가시킵니다. 인간 피부 섬유아 세포 (HDFs)의 도입은 maximally되는 고분자 농도가 관심의 대상 세포 유형에 대한 titrated되어야 제안, 이전에 암 세포 라인에 대한보고 최적의 가치보다 약 4 배 낮은 CS / PB 농도를 사용하여 향상된 것입니다. 따라서 새로운 셀 타입 고분자 독성에 대한 분석을 methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium 브로마이드 (MTT)의 사용을 설명합니다. 우리는 최소한의 급성 독성을 나타내는, 폴리머 complexation 또는 polybrene (PB, 6 μg / ML)의 표준 복용량을 사용하여 바이러스 전달 후 HDFs의 동등한 가능성을 관찰합니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 biosafety 위험을 줄이고 전달 속도를 증가, 인간의 세포에 oncogenes의 overexpression에 대한 ecotropic lentivirus의 사용을 설명합니다. 바이러스 입자 에어로졸 - 성형 원심 분리를 피하는 동안 우리는 또한 전달을 향상시키기 위해 고분자 complexation의 사용을 보여줍니다.
프로토콜
1. 렌티바이러스 생산, 수확 및 동결
- 본 프로토콜을 시작하기 전 소속 기관의 안전 관리 책임자와 상담하고, 권장되는 안전 가이드라인을 준수하십시오.
- 1일 차. 바이러스를 생산하기 위해 건강하고 빠르게 성장하는 293T 세포로 시작하십시오. 세포를 5 x 106 10 cm 플레이트당 세포 수. 바이러스 생산에는 항생제가 없는 293T 배지(10% FBS와 4 mM L-glutamine이 포함된 고농도 포도당 DMEM)를 사용하십시오.
- 2일 차. 늦은 오후에 다음과 같이 293T 세포를 형질전환합니다 (제시된 수치는 10cm 플레이트 1개 기준입니다). 모든 시약을 실온에서 예열하십시오. 파이펫으로 분주하여 375 μl 마이크로원심분리 튜브에 OptiMEM을 넣은 후, 다음을 추가합니다. 25 μl Fugene HD. 희석되지 않은 Fugene이 튜브 표면에 닿지 않도록 하십시오.
- 마이크로 원심분리 튜브에 다음을 넣고 혼합하십시오:
- 5 μg 전달 플라스미드 (Slc7a1, 표적 벡터 또는 형광 대조 벡터)
- 3.75 μg 패키징 플라스미드 (pCMV-dR8.91 또는 psPax2)
- 1.25 μg 외피 플라스미드(범용성-pantropic의 경우 pMD2.G, 세포친화성-ecotropic의 경우 pHCMV-EcoEnv)
- 혈청 제거 OptiMEM으로 100 μl
- 두 튜브를 합치고 혼합물을 실온에서 20~30분 동안 배양하십시오.
- 293T 세포의 배지를 10ml의 신선한 항생제 무첨가 293T 배지로 교체하십시오. Fugene/플라스미드 혼합물을 플레이트에 한 방울씩 첨가하고 다음 온도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 37°C, 5% CO22.
- 3일 차. 293T 세포의 배지를 10ml의 신선한 항생제 미포함 293T 배지로 교체하십시오. 293T 세포는 부착력이 약하며, 배지를 단일층 위에 너무 강하게 피펫팅하면 세포가 떨어져 나갈 수 있으므로 조심스럽게 조작하십시오. 바이러스 생산을 위해 습도가 조절된 배양기에서 2일 동안 배양하십시오.
- 5일 차. 바이러스를 수확하고 0.45 mm 저단백 결합 필터로 여과한다. 즉시 사용하거나 1회용 분주량으로 나누어 -에서 냉동 보관한다.80°C냉동 보관된 범친화성(pantropic) 및 외친화성(ecotropic) 바이러스는 각각 6개월 및 1개월 후에 역가를 재측정해야 합니다.
- 형질전환 효율이 비교적 높은 세포를 사용하여 다음과 같이 바이러스 역가를 측정합니다. 신선한 배지가 포함된 상태에서 연속 희석(예: 1:10, 1:10, 1:10)을 통해 형광 대조 바이러스를 세포에 하룻밤 동안 형질전환합니다. 6 μg/ml PB. 다음 날 신선한 배지로 교체하십시오. 형광 단백질이 발현되기까지 형질 도입 후 2일 동안 세포를 배양한 다음, FACS를 통해 형질 도입된 세포의 비율을 결정하십시오. 다음의 희석 배수에서 얻은 결과에 기초하여 ml당 형질 전환 단위(TU)로 역가를 계산하십시오. < 다중 형질전환 사건을 최소화하기 위해 15%의 형질전환율을 유지합니다.
2. 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a1을 이용한 인간 표적 세포의 형질도입
- 대부분의 세포가 형질전환될 수 있도록 감염다중도(MOI)를 2로 선택하십시오. HDF와 같이 형질전환에 저항성이 있는 표적 세포의 경우 더 높은 MOI가 필요하며, 본 실험에서는 대다수 세포의 형질전환을 유도하기 위해 바이러스 상층액을 1:2로만 희석하였습니다.
- 신선한 배양 배지에 희석된 바이러스 상층액을 사용하여 대상 세포를 하룻밤 동안 형질전환한다. 6 μg/ml PB는 바이러스와 표적 세포 사이의 정전기적 상호작용을 강화하여 형질도입 효율을 높입니다.1 형질 도입 효율에 있어 확산이 제한 요인이 되므로, 35 mm 플레이트의 경우 1 ml와 같이 최소량의 바이러스를 사용하는 것이 이상적입니다.
- Slc7a1 수용체가 충분히 발현되도록 하기 위해, 바이러스를 제거한 후 최소 48시간 동안 세포를 배양한 다음 ecotropic 바이러스를 형질도입하십시오.
- (선택 사항) 원하는 경우, blasticidin을 사용하여 Slc7a1을 발현하는 안정적 형질전환 세포를 선택할 수 있습니다. 일반적으로 2 – 사이인 최저 유효 농도를 결정하기 위해 사전에 blasticidin 사멸 곡선(kill curve)을 작성해야 합니다. 10 μg/ml이는 7일 이내에 형질전환되지 않은 모든 표적 세포를 사멸시킵니다. Slc7a1 바이러스를 제거하고 약 2일 후에, 형질전환된 세포를 blasticidin이 포함된 배지로 교체합니다. 세포를 blasticidin 포함 배지에서 7일 동안 배양하면, 남아 있는 모든 세포가 레트로바이러스 수용체를 안정적으로 발현하게 되며, 이때부터 ecotropic 바이러스로 형질전환하거나 향후 사용을 위한 안정적 Slc7a1 발현 세포주로 보관할 수 있습니다.
3. 독성 결정을 위한 폴리머 복합체 적정
- 1일 차. 96-well 플레이트에 웰당 50 cells/well의 밀도로 세포를 분주하며, 각 실험군당 최소 3개 이상의 반복 웰을 확보한다. 건강한 세포의 기준값을 제공하기 위해 완전 배지 내의 비형질전환 세포를 포함시키고, 대조군으로서 성장 정지를 유도하기 위해 무혈청 배지 내의 세포로 구성된 샘플을 포함한다. 이와 병행하여, 각 실험 조건에서 형질전환 효율을 현미경 또는 FACS 기반으로 분석하기 위해 적절한 형식(예: 24-well 플레이트)으로 세포를 분주한다.
- 2일 차. MTT 및 FACS 분석을 위해 준비된 플레이트의 세포에 target 세포의 약 40%가 형질전환되도록 0.5의 MOI로 GFP를 인코딩하는 바이러스를 형질전환시킨다. 최적량을 결정하기 위해 다양한 농도의 CS/PB(예: 각 성분당 50, 10, 20, 40, 60, 800 mg/ml) 및 6 μg/ml PB를 테스트한다. 폴리머 복합체는 아래의 Part 4에 설명된 대로 생성한다.
- 3일 차. 바이러스가 포함된 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체한다. 플레이트를 습윤 배양기에 넣는다.
- 5일 차. FACS 플레이트를 분석하여 각 폴리머 농도에 따른 형질전환 효율을 결정한다.
- 6일 차. MTT 플레이트의 모든 웰에서 배지를 제거하고 10 μl MTT 용액(완전 배지 내 1 mg/ml MTT)으로 교체한다. 대사 활성 세포의 미토콘드리아에서 MTT가 환원될 수 있도록 습윤 배양기에서 3시간 동안 배양한다.
- MTT 용액을 제거하고 20 ml MTT 용매(isopropanol 내 0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630)로 교체한다.
- 실온에서 2시간 동안 또는 보라색 MTT formazan 침전물이 모두 용해될 때까지 배양한다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하고, 690 nm에서의 배경 값을 뺀다.
- FACS로 결정된 형질전환의 최대 향상을 유도하면서, MTT로 결정된 대사 활성에 미치는 영향이 최소화되는 최적의 폴리머 농도를 선택한다. HDFs의 경우, 아래의 대표 결과(Representative Results)에 제시된 데이터를 기반으로 10 μg/ml CS/PB를 선택하였다.
4. 폴리머 복합체 형성을 통한 에코트로픽 형질도입
- PB와 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate)의 멸균 여과된 20 mg/ml 수성 스탁 용액을 준비합니다. 소분하여 -20°C에서 보관합니다.
- 바이러스 상청액을 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 신선한 배양 배지로 희석하여 원하는 최종 농도(예: MOI 2)로 맞춥니다. PB와 콘드로이틴 황산염(위의 3단계에서 결정된 농도)을 동일한 부피로 순차적으로 첨가하고, 각 첨가 후 튜브를 톡 쳐서 혼합합니다. 침전물이 형성되면서 바이러스 혼합액이 즉시 탁해집니다. 복합체 형성을 위해 바이러스 혼합액을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 수용체 발현 표적 세포에서 배지를 제거하고 바이러스 혼합액으로 교체한 후, 37°C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 바이러스 혼합액을 제거한 후, 바이러스 복합체 제거를 돕기 위해 세포 표면을 PBS로 2회 세척합니다. 완전히 제거할 필요는 없으며, 잔류 폴리머 복합체가 세포 건강에 미치는 부정적인 영향은 관찰되지 않았습니다.
5. ecotropic 형질도입의 특이성 검증
- 에코트로픽(ecotropic) 바이러스를 처음 생산할 때, 안전 관점에서 바이러스가 변형되지 않은 인간 세포를 형질전환시킬 수 없는지 확인하는 것이 바람직합니다. 상대적으로 높은 농도의 에코트로픽 렌티바이러스(신선한 배지에 바이러스 상청액을 1~2배만 희석)와 6 μg/ml PB 또는 최적화된 CS/PB 농도를 사용하여 인간 세포를 하룻밤 동안 형질전환시킵니다.
- 바이러스가 포함된 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체합니다. 세포를 2일 동안 배양한 후, 형광 벡터를 이용한 FACS 또는 트랜스진 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR을 통해 트랜스진 발현을 검증합니다.
6. 대표 결과:
그림 1A는 렌티바이러스 생성 과정을 보여주며, 그림 1B는 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a1의 사전 형질전환을 포함하여 인간 세포에 에코트로픽(ecotropic) 렌티바이러스를 형질전환하는 과정을 보여줍니다. 바이러스 역가 측정을 위해, Slc7a1이 안정적으로 형질전환된 인간 횡문근육종 세포주(Slc-hRMS)를 사용합니다. 형질전환 효율을 모니터링하기 위해 형광 대조 벡터를 사용할 때, 일반적으로 다음과 같은 결과를 얻습니다. > 그림 2A 및 2B에 나타난 바와 같이, ecotropic virus를 이용한 Slc-hRMS의 형질도입 효율은 90%입니다. HDF의 형질도입률은 일반적으로 더 낮게 나타나는데, 이는 해당 세포들이 수용체 발현을 위해 blasticidin 선택 과정을 거치지 않았기 때문입니다(그림 2C). Slc-hRMS에서 측정했을 때, ecotropic lentivirus의 타이터(titer)는 일반적으로 VSV-pseudotyped virus의 10-20% 수준입니다(그림 2D).
한 번의 동결-해동 주기는 ecotropic virus의 역가를 16 - 3% 감소시키며, 이는 VSV-pseudotyped virus의 단일 동결-해동 주기 동안의 역가 손실과 동일합니다 (p > 0.05). 이전 보고서들과 달리,2 드라이아이스를 이용한 급속 냉동이 바이러스 역가에 긍정적인 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었습니다. 오히려 바이러스 튜브를 -80°C 냉동고에 단순히 보관함으로써 두 pseudotype 모두 더 높은 해동 후 역가를 얻었습니다 (데이터 미제시).
MTT 생존능 분석을 통해 표적 세포의 성장 정지를 민감하게 검출할 수 있습니다. 바이러스와 최대 80 μg/ml 농도의 CS/PB를 함께 전달했을 때 HDF 대사에는 영향이 없었습니다(그림 3A). 바이러스 없이 CS/PB에만 노출시킨 경우에도 세포에 독성 효과는 나타나지 않았습니다(데이터 미제시). 바이러스와 다양한 농도의 CS/PB를 함께 전달한 HDF의 FACS 분석 결과, PB 단독 처리와 비교하여 전달 효율이 향상되었음을 확인하였습니다(그림 3B). 최대 향상 효과는 10 μg/ml CS/PB에서 나타났으며(그림 3C), 이는 이전에 보고된 수치보다 수 배 더 낮은 농도입니다.3 따라서 특정 표적 세포 유형에 맞게 조건을 최적화하는 것이 중요합니다.
CS/PB와의 복합체 형성은 Slc-hRMS에서 관찰된 역가를 약 3배 향상시킵니다 (그림 4A, p < 0.01). 실제로, 이는 고농도의 바이러스보다 저농도의 바이러스에서 형질전환 효율에 더 큰 영향을 미치며 (그림 4B), 이는 고농도의 바이러스에서 다중 형질전환된 세포와 수용체 포화 현상이 발생하기 때문일 가능성이 가장 높습니다.
ecotropic 바이러스를 이용한 형질전환은 마우스 레트로바이러스 수용체를 발현하는 세포에 특이적입니다. 그림 5A에 나타난 바와 같이, 수정되지 않은 인간 세포에 ecotropic 바이러스를 형질전환할 때 PB 또는 CS/PB 사용 여부와 관계없이 형질전환되지 않은 배경값보다 큰 형광은 관찰되지 않았습니다. 현미경 관찰 결과, 수용체가 없는 경우 HDF에서는 형질전환이 나타나지 않았으나(그림 5B), 수용체를 사전 형질전환한 경우에는 형광 세포가 나타났습니다(그림 5C).
그림 1. ~의 모식도 (A) 바이러스 생산 과정 및 (B) 마우스 레트로바이러스 수용체를 이용한 인간 세포의 형질전환 및 이어지는 에코트로픽 렌티바이러스 형질전환.
그림 2. GFP를 인코딩하는 ecotropic 렌티바이러스를 이용한 인간 세포의 고효율 형질도입. 세포는 마우스 레트로바이러스 수용체인 Slc7a1로 사전 형질도입되었다. (A) Slc7a1에 대해 블라스티시딘(blasticidin) 선택 과정을 거친 인간 횡문근육종 세포주(Slc-hRMS), GFP로 형질도입됨(파란색) 또는 형질도입되지 않음(분홍색). (B) ecotropic-형질전환된 Slc-hRMS의 형광 현미경 사진 (4배율). (C) ecotropic GFP 렌티바이러스로 형질전환된(파란색) 및 형질전환되지 않은(분홍색) HDF; 세포들은 ecotropic 형질전환 2일 전에 Slc7a1로 형질전환되었다. (D) Slc-hRMS에서 측정된 VSV-G 슈도타입 및 ecotropic 렌티바이러스의 역가.
그림 3. 인간 진피 섬유아세포에서 콘드로이틴 황산/폴리브렌(CS/PB) 농도 최적화. (A) PB만 단독으로 처리했거나 다양한 농도의 CS/PB를 함께 처리하여 형질전환시킨 후, MTT 분석으로 측정한 HDF의 생존율. (B) FACS로 측정한 서로 다른 농도의 CS/PB에 의한 HDF의 형질도입 효율 향상. (C) 형질전환 증강의 정량화; 최대 형질전환이 발생하는 지점을 보여줌 100 μg/ml 컴퓨터 과학/생물물리학.
그림 4. ~의 효과 400 μg/ml ecotropic 렌티바이러스를 이용한 Slc-hRMS 형질전환에 관한 CS/PB. (A) 역가 향상 및 (B) ~ 대비 도입률의 배수 변화 6 μg/ml polybrene 단독 처리.
그림 5. 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a1이 없을 때 인간 진피 섬유아세포(HDFs)의 에코트로픽 형질전환 결핍. (A) 수용체 Slc7a1이 없는 상태에서 ecotropic GFP 렌티바이러스를 처리하지 않은(분홍색) 또는 처리한(파란색) BJ 인간 섬유아세포의 FACS 플롯. ecotropic GFP 렌티바이러스를 처리한 BJ 인간 섬유아세포, - 없이 (B) 및 ~와 함께 (C) 수용체 Slc7a1(4X)을 이용한 사전 형질전환.
토론
몰로니 murine의 백혈병 바이러스 (MLV)과 그 수용체 mSlc7a1에 따라 재조합 ecotropic gammaretrovirus 잘 연구하고 널리 없습니다 murine 세포 transgenes를 제공하기 위해 20여 년 동안 사용되고 보내고있다. Ecotropic gammaretrovirus도 인간의 세포 oncogenes를 제공하기 위해 최근 사용되고 있습니다,. 셀룰러 프로그래밍의 맥락에서, mSlc7a1의 사용은 잘 설립 인간 oncogenes을 품고 amphotropic 바이러스의 생성을 피하기 위해 4,5 단, lentivirus은 gammaretrovirus에 비해 상당한 장점을 제공합니다 lentiviral 사전 통합 복잡한 허용하기 때문에 내화물 세포 집단, 종종 프로그래밍을 위해 바람직 목표물 6를 포함한 기본 세포를 transducing가 아닌 나누어 세포의 형질 도입 7.
Lentiviruses는 바이러스 tropism, 독성, 및 기타 특성 8. MLV - pseudotyped ecotropic의 lentivirus은 마우스 세포, 9 transduce하는 데 사용되었지만 거의 인간의 세포에 사용되지 않은 내용을 변경하기 위해 MLV를 포함한 다양한 pseudotypes 수십, 함께 제작되었습니다 10. 우리는 따라서 인간의 세포에 세포 프로그래밍 요소를 포함하여 알려지거나 의심 oncogenes을, 제공하는 안전하고 비용 효율적인, 그리고 고효율 차량으로 MLV - pseudotyped ecotropic lentivirus의 사용을 제안합니다.
오히려,이 프로토콜은 암 관련 바이러스 자체 접종 잠재력에서 연구자를 단열, pantropic 바이러스에서 oncogene (들)을 분리, 그것은이 프로토콜은 완전히 pantropic lentivirus을 생산하고 사용할 필요성을 제거하지 않습니다에 중요합니다. 단백질 mSlc7a1과 인간 homologue의 hSlc7a1는 ubiquitously 알려진 tumorigenicity 또는받는 사람 세포에 선택 성장 우위를 부여하는 능력, amphotropic 바이러스에 설립에 대한 상대적으로 낮은 위험이 11 만들기 mSlc7a1 아니요 아미노산 운반을 표명하고 있습니다. 이것은 추가 단계 필요 biosafety 수준의 전용 바이러 스나 조직 문화 시설 부족 실험실에서 특히 유용할 수 있습니다.
어떤 상황에서는 완전히 대상 세포에 직접 Slc7a1이 플라스미드 transfecting에 의해 pantropic 바이러스의 사용을 제거하는 것이 가능 수 있지만,이 기술의 유용 대상 될 많은 세포는 transfection에 내화물 있습니다. 대안으로 분리할 수있는 능력 blasticidin 선택하여 세포를 Slc7a1는 - transduced 것은 VSV - G pseudotyped lentivirus가 ecotropic 바이러스가 많은 이들 세포를 transduce하기 위해 일상적으로 사용할 수있는 이후 수용체 - 표현 세포의 주식을 생성 한 번 사용될 수있다는 것을 의미 실험. 연구원에 관계없이 항상 그 tropism의 모든 lentivirus 작업을 위해 제도적 안전 지침을 따라야합니다.
이 프로토콜과 함께 실현 ecotropic 바이러스 Titers 이전 연구와 합의에 일반적으로 VSV - pseudotyped 바이러스, pantropic 바이러스 titer의 10~20%보다 적당히 낮은 9. 이러한 titers가 안정 Slc7a1와 transduced 인간의 세포로 측정되었다, 그래서 낮은 ecotropic 바이러스에 대한 관찰 titer는 대상 세포에있는 수용체 유전자의 다양한 표현에 일부가 원인일 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 우리 프로토콜 획득 바이러스 titers은 대부분의 어플 리케이션을위한 충분한보다되며 어떤 경우에는 세포의 과반수의 도입으로 이어질> 세포의 90 %.
원심 분리 기반 기술은 일반적으로 바이러스 입자를 집중하는 데 사용됩니다. 그러나, 원심 분리는 몇 시간을 필요로 전염성 에어로졸을 생성하고, 바이러스 입자의 상당한 손실이 발생할 수 있습니다. 12 대안, CS / PB와 함께 complexation으로이 바이러스 tropism를 변경하지 않고 전달을 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 3이 방법은 (5 분 빠른있다 대략 관찰된 titer를 tripling 동안 (10 ML 바이러스 당 $ 0.03)) 저렴. 특별한 장비 또는 독점적인 시약이 필요하지 않으며 다른 세포 라인의 이전 작업과 동의, CS / PB에 HDFs의 노출 후 최소한의 급성 독성을 관찰하고 있습니다.이 프로토콜 13 한 잠재적인 단점이 몇 가지 미세 표시 폴리머 단지가 고수이다 문화에 몇 일 동안 세포. 우리는이 단지는 세포에 독성 명백히 없지만, 세포 프로세스에 대한 자세한 미묘한 영향을 수있는 가능성을 배제할 수 없습니다.
여기 우리는 안전하고 효과적으로 종양 발생 요인과 인간의 세포를 transducing위한 방법론을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 IPS 세포를 포함한 oncogenes 및 줄기 세포 생물학을 공부하면서 연구에 큰 유틸리티의해야합니다.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 프로젝트에 대한 자금은 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 제공되었다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17,224 | Murine MLV 수용체 |
| pMD2.G | Addgene | 12,259 | VSV - G 봉투 |
| pCMV - dR8.91 | D. Trono 연구소 14 | 포장 플라스미드 (이에 상응하는 플라스미드 psPax2가 Addgene에서 구할 수 고양이. 넘버 12260) | |
| pHCMV - EcoEnv | Addgene | 15,802 | Ecotropic 봉투 |
| FUGW | Addgene | 14,883 | 플라스미드 GFP 제어 |
| OptiMEM | Invitrogen | 31,985 | |
| Fugene HD | 로체 | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine 브로마이드 (Polybrene) | 시그마 - 알드리치 | H9268 | |
| 상어 연골의 콘드로이틴 황산 나트륨 소금 | 시그마 - 알드리치 | C4384 | |
| Blasticidin S | 어부 | BP 2,647,100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium 브로마이드 (MTT) | 시그마 - 알드리치 | M2128 | |
| Igepal CA - 630 | 시그마 - 알드리치 | I3021 |
참고문헌
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- Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
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