본 논문은 aortas의 면역 성분을 조사하기 위해 흐름 cytometry 기반 방법을 제공합니다. 신문은 또한 별도로 주변 adventitia 및 혈관 벽을 검사 수 있습니다 추가 기법을 보여줍니다. 이 방법은 대동맥 leukocytes의 phenotypical 분석을 수행하고 죽상 경화증 연구에 대한 몇 가지 면역 assays을 적용하는 가능성을 엽니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
죽상 경화증은 거품 세포, 면역 세포, 혈관 내피 및 평활근 세포, 혈소판, 세포외 기질, 그리고 광범위한 괴사와 지질이 풍부한 코어로 구성된 plaques의 형성에 의해 특징 있으며 중간 및 대형 선박의 만성 염증성 과정 주변 조직의 섬유증. 면역 반응 1 타고난과 적응 무기가 죽상 경화증의 개시, 개발 및 지속성에 참여합니다. 2, 3이 증거의 중요한 기관이다 같은 macrophages로 면역 세포의 서로 다른 하위 집합, 돌기 그 세포, T 및 B lymphocytes은 건강하고 죽상 경화증 발생하기 쉬운 생쥐 4 aortas 내에 존재한다. 또한 면역 세포는 atherogenesis이 조직의 중요한 역할을 제안 주변 대동맥 adventitia에서 찾을 수 있습니다. 2
얼마 동안, 면역 세포들이 활성화 상태 및 대동맥 벽 내의 세포 성분의 다른 유형의 양적 감지 죽상 경화증의 연구에 대한 RT - PCR과 immunohistochemical 방법으로 제한되었다. 몇 가지 시도는 인간의 aortas를 사용하여 유동세포계측법을 수행하기 위해 만들어진, 그리고 높은 autofluorescence 같은 문제의 숫자가 5,6를보고되었습니다. 인간 atherosclerotic plaques는 collagenase 1 소화했고, 무료로 세포는 CD14에 대한 수집 및 스테인드되었습니다 + / CD11c + 대식 세포 - 파생 거품 세포를 강조합니다. 본 연구에서는, "모의"채널은 거짓 - 긍정적인 얼룩을 방지하는 데 사용되었다. 소화 과정에서 축적 6 괴사성 물질 대동맥 표본에서 높은 autofluorescence를 생성 파편 많은 양의 상승을 제공합니다. 이 문제를 해결하려면, 부정과 긍정적인 컨트롤 패널이 제안되어 있으나, 이중 염색법는이 샘플에 적용 될 수 있습니다. 우리는 면역 세포 성분을 분석하고 활성화, 증식, 건강하고 죽상 경화증 발생하기 쉬운 대동맥에서 면역 세포의 분화를 특징하는 새로운 흐름 cytometry 기반의 방법 7을 개발했습니다. 이 방법은 대동맥 벽의 면역 세포 조성의 조사를 허용하고이 질병의 면역 측면의 조사에 대한 면역 방법의 광범위한 스펙트럼을 사용하는 가능성을 엽니다.
프로토콜
1. murine aortas의 분리
절차의 기관 IACUC위원회의 승인은 마우스 작동하도록해야합니다.
- 50 ML PBS와 혼합하는 반전 튜브에 헤파린 나트륨 1000 단위를 추가하여 heparinzed PBS를 준비합니다. 혈액 및 수거 각 대동맥에 대한 PBS를 포함하는 컬렉션 튜브 빈 컬렉션 튜브를 준비합니다. 얼음의 모든 튜브 보관하십시오.
- 그리기 혈액 (1000 U / ML 헤파린 나트륨의 0.1ml)을 주사기를 Heparinize, 수술 도구 (두 곡선 포셉의 쌍, 해부 가위, 그리고 microshears 한 켤레) 및 해부를위한 해부 무대를 준비합니다.
- NIH와 설치류의 안락사에 관한 기관 IACUC위원회 정책을 다음과 승인 챔버의 이산화탄소를 사용하여 마우스를 안락사. 해부 단계로 마우스를 전송하기 전에 효과가 있는지 확인합니다.
- 간단히 70 % 에탄올로 마우스를 흡수하고 해부 단계로 마우스를 고정. 심장 찔린 통해 마우스에서 혈액을 그립니다.
- 복부와 가슴 충치를 엽니다. 25g의 바늘로 10 ML의 주사기를 사용하여 완전히 PBS 완전히 심장 주사하여 혈관에서 혈액을 제거하는 헤파린의 2 %를 포함하는으로 vasculature을 pe....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기, 우리는 murine aortas의 면역 세포 조성의 조사를위한 흐름 cytometry 기반의 방법을 제시한다. 이 방법의 가장 큰 장점은 단일 세포 수준에서 대동맥 면역 세포를 분석하고 대동맥 leukocytes의 정품 인증 상태를 특징하는 능력입니다. 이 방법은 murine aortas로 제한하고 (발표되지 않은 데이터) 등 10 등 내유 동맥, 대동맥 밸브 및 관상 동맥과 같은 인간의 표본을 분석하기 위해이 접근법을 사용하지 않습니다. 이 방법 중 하나는 제한이 단일 aortas을 찾았 murine 대동맥의 leukocytes의 상대적으로 낮은 숫자입니다. 단일 atherosclerotic의 대동맥에서 발견한 leukocytes의 수가 유동세포계측법 실험을위한 충분하지만, 풍부하게 낮게 세포는 하나의 대동맥의 세포 현탁액에 감지하기 어려울 수 있습니다. 필요한 경우,이 문제는 유동세포계측법의 얼룩 2-4 aortas에서 결합된 샘플을 사용하여 피할 수 있습니다. 또한, 효소 처리 후 표면 항원의 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
PO1 HL55798 (KL)를 미국 심장 협회 과학 발전 부여 0525532U (예)을 :이 작품은 보건 부여의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 자료 | 카탈로그 번호 | 회사 | |
| Collagenase XI | C7657 | 시그마 - 알드리치 | |
| Hyaluronidase | H3506 | 시그마 - 알드리치 | |
| DNase I, 2를 입력합니다 | D4527 | 시그마 - 알드리치 | |
| Collagenase I | C0130 | 시그마 - 알드리치 | |
| Collagenase II | LS004174 | 워싱턴 생물 코퍼레이션 | |
| 엘라스타제 | LS002292 | 워싱턴 생물 코퍼레이션 |
참고문헌
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Hansson, G. K., Libby, P.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
