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방법 논문

마우스의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 중간 대뇌 동맥 Intraluminal 폐색 (MCAO) 모델

51.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/2879

⸱

2011년 5월 8일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델은 실험 허혈성 뇌졸중 모델 중 가장 자주 사용되는 모델입니다. 여기서 우리는 전체 레이저 도플러 flowmetry의 가이드와 함께 상세하게 모델 및 대표 결과를 보여줄 것입니다.

초록

스트로크 2009 1,2 년 미국에서 근처 70,000,000,000달러의 예상 비용, 죽음의 세 번째 주요 원인과 세계에서 장애의 주요 원인이다. intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델 쥐에 impactful 인간의 병리 현상을 시뮬레이션하기 위해 1986 년 고이즈미 사에 의해 개발되었습니다. MCAO 방식의 수정은 나중에 롱가 3 수여되었다. 두 기술은 널리 허혈성 뇌졸중 및 잠재적인 치료 modalities 5로 인한 뇌 손상의 분자 메커니즘을 식별하는 데 사용되었습니다. 쥐이 비교적 비침 투 방법은 유전자 변형과 녹아웃의 변종 6,7을 활용하는 마우스에 사용하도록 확장되었습니다. 모델 초점 대뇌 국소 빈혈하려면, intraluminal 봉합은 MCA의 기반을 막다하기 위해 내부 경동맥을 통해 고급입니다. 지정된 기간 후에 Retracting 봉합사는 자연 reperfusion을 모방한 것이었지만, 봉합도 영구적으로 유지하실 수 있습니다. 이 동영상은 stepwise 방식의 생쥐에 intraluminal MCAO 절차를 수행하기위한 두 가지 주요 접근 방식을 보여주는,뿐만 아니라 잠재적인 단점과 함정에 대한 통찰력을 제공합니다. 허혈성 뇌 조직은 이후 대뇌 경색 8 정도를 평가하는 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC)로 물들일 것이다.

프로토콜

이 프로토콜은 기관 애니멀 케어 승인 및 플로리다 대학에서위원회 (IACUC)를 사용하고 "연구소 동물 관리의 원리"(NIH 간행물 번호 86-23, 1985 개정) 준수가되었습니다.

1. 자료

  1. 동물 : 수술 시에 20-26그램 무게 남성 C57BL / 6 마​​우스 (할렌 연구소, 인디애나 폴리스, IN, 미국).
  2. 마취 :
    1. 마취 기계 : VetEquip의 흡입 마취 시스템 (VetEquip 주식 회사, 플레즌턴, CA, 미국).
    2. 마취 흡입 : Isoflurane (백스터 조제학, 디어 필드, IL).
  3. 수술 도구 : SuperCut 이리스 가위, 스트레이트 (세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국), Vannas 마이크로 가위, 직진 (세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국), 더몬트 포셉 (좋은 팁, 45 ° 벤트 팁, 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국), 바이폴라 응고 장치 (고주파 건조기 900 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국), 마이크로 선박 클립 (세계 정밀 계측기, 주식, 사라소타, 플로리다, 미국)
  4. 외과 용품 : 무균 커튼 팁, 잎사귀, 압박 붕대 스펀지, 봉합사 (7-0 실크 봉합사, Ethicon, 주식 회사, 서머빌, 뉴저지, 미국), 조직 접착제 (Vetbond, 3M 회사, 세인트 폴, 미네소타, 미국); 외과 스크럽 : Bethadine, 70 % 에탄올 및 멸균 식염수 0.9 %, 아이 연고 (Puralube 베트 연고, Pharmaderm, 멜빌, NY, 미국).
  5. MCAO을위한 폐색 봉합 준비 :
    1. MCA 폐색을위한 필라멘트 : 7-0 외과 나일론 monofilament의 봉합 (Ethicon, 주식 회사, 서머빌, 뉴저지, 미국).
    2. 봉합사 팁 (열 소작 단위, 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다)을 둔화에 대한 열원.
    3. 액체 실리콘 고무 (실리콘 RTV 접착제, 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국).
  6. 현미경을 분석 해 봅시다 / 외과 (Leica 스테레오 현미경 MZ6).
    1. 광섬유 조명기 (광섬유 조명기 FO1 - 150, TechniQuip 공사, 리버 모어, CA, 미국).
  7. 레이저 도플러 flowmetry (PeriFlux 시스템 5000, Perimed, 스톡홀름, 스웨덴).
    1. 유연한 microtip (MT B500 - 0 스트레이트 Microtip, Perimed, 스톡홀름, 스웨덴)
  8. 온도 매개 변수 :
    1. 직장 온도 모니터 (BAT - 12, 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, FL).
    2. 열전달 담요 (T / 펌프 TP600, Gaymar, NY, 미국).
  9. 얼룩 및 볼륨 경색의 양적 측정 :
    1. 2 % 솔루션 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (2 % TTC, 시그마 - 알드리치 (주), 세인트 루이스, MO, 미국).
    2. 쥐 두뇌 행렬 슬라 이서 (Zivic - 밀러 연구실., 주식 회사, 앨리슨 공원, PA, 미국).
    3. 디지털 카메라 (V1253, 코닥 (주), 로체스터, NY, 미국).
    4. 이미지 J 소프트웨어 (ImageJ 1.42q 소프트웨어, 건강의 미국 국립 연구소, 베데스다, MA, 미국).

2. 사전 외과 단계

  1. 이전 수술로, 생쥐는 설치류 물과 식량을 무료로 이용할 수있는 12시 12분 어둠 / 빛이주기 밑에 위치해 있습니다.
  2. MCAO에 대한 봉합은 그것이 (7-0 건조 수 있도록, 열 및 액체 실리콘 고무와의 팁에서 코팅 봉합 샤프트의 3-4mm로 봉합 팁의 1-2mm을 둔화에 의해 준비되며 팁 직경 0.20 - 0.25mm; 코팅 길이, 3~4밀리미터, 봉합 길이 11~13mm). 불임은 위에서 언급한 모든 단계에서 보존해야합니다.
  3. 마우스를 무게 후 마취가 유도 챔버에서 isoflurane 4퍼센트와 유도는 30 % O 2 70% N 안면을 통해 2 O 가스 혼합물에서 isoflurane 1.5-2 %로 절차를 수행하는 동안 유지.
  4. 마우스는 온도 제어 운영 표면 (열 담요)에 누워 거즈 패드에 발생하기 쉬운 위치에 배치되며 머리 모피는 면도 있습니다.
  5. 윤활유 안과 연고는 양쪽 눈 모두에 적용되며, 눈꺼풀은 수술 과정 중에 안구 건조를 막기 위해 폐쇄됩니다.
  6. 정중선 절개 (1cm)은 nasion과 피부가 부착 유연한 microtip을 (; 0.5mm 직경 MT B500 - 0 스트레이트 Microtip)에 옆으로 뽑아입니다 뛰어난 nuchal 라인에서 두개관을 overlying 피부에 이루어집니다. microtip는 레이저 도플러 flowmetry하여 MCA 영역에 혈액 흐름을 모니터 오른쪽 정수리 두개골의 표면 (후부 1mm 및 bregma에 측면 5mm)에 직각 배치됩니다.
  7. 동물 부정사 위치로 설정되어 전에 유연한 microtip 단단히 두개골에 첨부되어 있는지 확인합니다. 동물의 목을은 부드러운 패드에 위치하고 코가 마취 장치의 코 콘에서 개최됩니다. 이것은 유연한 microtip을위한 충분한 공간이 필요하게됩니다.
  8. 직장 온도 프로브는 ± 0.5 ° C.는 37 상수 동물 코어 온도를 유지하기 위해 삽입
  9. 모두 forepaws과 hindpaws는 운영 플랫폼 표면 녹화하고 있으며, 꼬리는 직장 관이 테이프로 붙여져 있습니다.

    10. 3. MCA 폐색 수술 :

    1. 운영 현미경, 정중선 목 절개는 부드럽게 풀어 피부를 리프팅하여 manubrium와 턱 사이에 가위로 이루어집니다.
    2. 이점 기본 턱밑 분비가 퉁명스럽게 현장에두고 왼쪽 선 (腺)으로 나누어집니다. 오른쪽 턱밑 글랜드는 cranially 철회하고 sternocleidomastoid 근육과 함께 안전합니다.
    3. 경동맥 칼집을 포함 omohyoid 근육의 노출된 부문은 신중하게 픽업과 함께 나눌 수 있습니다.
    4. 바로 일반적인 경동맥 (CCA)는 조심스럽게 미주 신경 및 칼집 (CCA로 측면에 위치)에서 분리하여 격리됩니다.
    5. 향후, MCA 폐색을 수행하기 위해 자주 사용되었습니다 2 수술 방법은 분기 :

    고이즈미의 4 방법

    1. 세 느슨한 칼라의 봉합 (7-0 비단)은 오른쪽 CCA 주변 준비가되어 있습니다.
    2. 외부 경동맥의 동맥 (ECA)는 식별 고립, 그리고 불로 지졌죠 (분기점에 말초 2-3mm)입니다. 이것은 이후에 마이크로 가위로 나눌 수 있습니다. 소작된 사이트에서 실수로 주변 피해를 방지하기 위해 전원은 전원 손잡이를 사용하여 1로 설정해야합니다. 이것은 모든 cauterizations에 대해 일치합니다.
    3. 충분한 긴장은 혈액의 흐름 (영구 결합)을 막다에 CCA에서 가장 근위 칼라 봉합에 적용됩니다. 흐름 폐색은 기본 대뇌 피질의 관류 값 ~ 50 % 드롭에 의해 확인됩니다.
    4. 그런 다음 선박 클립 arteriotomy의 시간에 역행 흐름을 피하기 위해 단지 CCA의 분기점 앞에 배치됩니다.
    5. arteriotomy는 마이크로 가위 (가까이 내고까지)와 근위 출혈도 잡았 봉합 및 CCA의 선박 클립 사이에 수행됩니다.
    6. 열 무딘 실리콘 코팅 7-0 나일론 봉합사는 arteriotomy를 통해 소개하고 선박 클립에 도달까지 고급입니다. 2 나머지 느슨한 칼라 봉합은 부드럽게 동맥 벽에 ...에 상처​​를 입히다하지 않는주의, CCA를 통해 흐름 누출을 다시 피하기 위해 arteriotomy 및 선박 클립 사이 CCA 주위 강화되며 다음 선박 클립이 철회됩니다.

    롱가의 3 방식

    1. ECA는 식별 불로 지졌죠 (1로 설정 전력), (언어 및 상악 동맥으로의 분기점 근처) 가능한 한 해부하고, 마이크로 가위로 나뉘어져 있습니다.
    2. 두 느슨한 칼라의 봉합 (7-0 실크)는 단지 CCA의 분기점 위의 근위 ICA 주변 준비가되어 있습니다.
    3. CCA는 일시적으로 혈관 클립과 함께 닫힙니다. 흐름 폐색은 기본 대뇌 피질의 관류 값 ~ 50 % 드롭에 의해 확인됩니다.
    4. 다음 ICA가 일시적으로 arteriotomy의 시간에 역행 흐름을 피하기 위해 두 느슨한 옷깃 봉합 위에 선박 클립과 함께 닫힙니다.
    5. arteriotomy는 유세에 반영 ECA 가까이에있는 마이크로 가위를 사용하여 수행됩니다.
    6. 열 무딘 실리콘 코팅 7-0 나일론 봉합사는 ECA에서 arteriotomy를 통해 소개하고 ICA에 적용 선박 클립에 도달까지 고급입니다. 근위 ICA에이 느슨한 칼라 봉합은 부드럽게 동맥 벽에 ...에 상처​​를 입히다 못할 정도로 관심과 ICA를 통해 환류 혈액 흐름을 피하기 위해 근위 ICA 주위 강화되며 다음 선박 클립이 철회됩니다.

    절차의 나머지 부분은 대부분 수렴입니다

    1. 가벼운 저항이 생각 때까지 occluding의 봉합은 천천히 두개골 기본 방향으로 내부 경동맥 (ICA)를 통해 고급입니다. 기준에 대한 상대적인 비율 (= 80 %)으로 대뇌 혈류의 가치에 동시 드롭은 레이저 도플러 flowmetry에 의해 확인됩니다. 2 칼라 봉합은 삽입 필라멘트 주위에 강화하고 있습니다.
    2. 일시적 대뇌 국소 빈혈 실험은 occluding의 봉합사는 45 분 후에 부드럽게 철회합니다. 이 시점은 다양한 실험적인 목표에 대해 변경할 수 있습니다.
    3. 봉합사 필라멘트를 철수 후, arteriotomy 사이트는 수술 후 출혈을 피하기 위해 닫힙니다. 고이즈미의 방법에서는, 이것은 안전 CCA 주위에 목걸이를 봉합을 강화 포함됩니다. 롱가의 기술에 ECA의 기지에서 arteriotomy 사이트가 불로 지졌죠는 다음 근위 ICA에서 칼라 봉합은 느슨하게하고 경동맥 흐름을 복원 제거됩니다.
    4. 절개를 닫으려면, 턱밑 글랜드과 SCM은 수술 분야를 통해 마련하고 있습니다. 상처의 가장자리는 다음 자궁 경부에서 조직 접착제와 두피 영역 approximated 있습니다. 또는, 흡수성 봉합 또는 금속 주식은 동물의 장기적인 생존을위한 것입니다 특히 상처를 가까이하는 데 사용할 수 있습니다.
    5. 절개 폐쇄 후, 동물 볼륨 보충으로 subcutaneously 1 ML 따뜻한 호수를받습니다. 적절한 진통제의 투여 (0.05-0.1 MG / kg에서 즉, Buprenorphine)는 복구 기간 동안 동물의 고통과 불편을 최소화하기 위해 사용해야합니다. 애니마나는 수술 스위트룸에서 제거하고 부드러운 음식과 물을 무료로 쉽게 접근할 수있는, 저체온증을 방지하기 위해 따뜻한 복구 지역 / 케이지에 있습니다.

    4. 수술 신경학 평가

    동물이 전체 의식을 차릴 후 3 다음과 같이 신경 결손은 간단한 스케일 (5 점 척도)에 의해 평가할 수있다 :

    1. 눈에 띄는 적자 없음
    2. contralateral 앞발 (온화한 초점 neurologic 적자)를 확장 실패
    3. 경색에 contralateral 방향으로 공전하는 (중간 초점 neurologic 적자)
    4. 경색에 contralateral 방향으로 떨어지는 (심각한 초점 neurologic 적자)
    5. 자발적인 움직임없이 의식의 우울 수준

    5. 얼룩 및 뇌 경색 볼륨의 양적 측정

    1. MCA의 reperfusion 24 시간 후, 남은 마우스는 4 % isoflorane와 깊이 anesthetized 무게이며, 승인된 프로토콜에 따라 희생.
    2. 두뇌는 신중하게 제거하고 마우스 뇌 매트릭스 기계에 배치하고, 전체의 꿈은 2mm 간격으로 coronally sectioned입니다.
    3. 섹션은 TTC는 인산염의 37 호수 (PBS)를 버퍼 2% ° 20 분 C로 포장되어 있습니다. TTC의 얼룩 후, infracted 지역은 붉은 벽돌 (가능한) 조직 (그림 1)에 인접한 흰색 (흠없는) 조직으로 표시됩니다.
    4. 시리얼 섹션은 이미지 J 프로그램 측정 디지털 카메라 경색의 면적을 사용하여 촬영하고 있습니다.
    5. 경색의 영역 (흰색, 흠없는), ipsilateral 반구 (스테인드, 벽돌 흰색과 빨간색) 분야, 그리고 contralateral 반구 (붉은 벽돌, 스테인드)의 영역은 각 섹션에 대한 측정입니다. 볼륨은 모든 섹션에서 대표적인 영역을 합산하여 슬라이스의 두께로 곱하여 계산합니다. 부종에 대한 보정 후, 경색의 볼륨은 다음과 9과 같이 계산됩니다 :
      수정된 경색 볼륨 (문학), % = [contralateral 반구 볼륨 - (ipsilateral 반구 볼륨 - 볼륨 경색)] / contralateral 반구 볼륨 X 100

    6. 대표 결과

    대뇌 국소 빈혈 과도를 확립하기 위해 왼쪽 CCA를 통해 폐색 및 MCA의 reperfusion 후, 동물 희생하고 자신의 coronally sectioned 두뇌는 경색의 볼륨 (그림 1)을 평가하는 TTC 물들일 수 있습니다.

    figure-protocol-1
    그림 1. 생쥐에서 TTC - 묻은 시리얼 코로나 두뇌 섹션 (2mm)는 MCA 폐색를 받게.

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토론

MCAO 모델은 murine 종의 대뇌 국소 빈혈을 복제 설립 모델입니다. 이 모델은 처음 쥐에 사용하고 이후 마우스에 적응했다. 혈액 뇌 장벽의 투자율과 intracranial 압력에 대한 수술 조작의 영향을 제거하는 craniectomy을 방지하는 것이이 기술의 장점입니다. 그러나, 이러한 스트레인과 관련된 차이가 10, 폐색 6, 체온 12, 마취 13 봉합 팁 11 기간의 크기 및 기타 요인에 많은 변수를이 모델에서 경색 볼륨에 불일치가 발생할 수 있습니다.
언급을 보증 구체적인 기술적인 세부 사항이 있습니다 :

  1. 코팅 봉합사의 끝 감소 천공의 위험이있는 MCA를 occluding위한 부드럽고 관리 치료를 생성합니다.
  2. 인접한 동맥에서 미주 신경 정말 그것은 실수로 칼라 봉합에 있으니까 별도로 안전하게 제한되지 않습니다. occluding의 봉합을 오름차순 동안 arteri...

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공개 사항

저자들은 이익에 대한 갈등이 없다는 것을 선언합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 유형 회사 카탈로그 번호 댓글 (옵션)
남성 C57BL / 6 마​​우스 동물 할런 연구소, 인디애나 폴리스, IN, 미국 20-26 GRS
해부 현미경 현미경 Leica 스테레오 현미경 MZ6 6.3:1 줌
광섬유 조명기 조명기 TechniQuip 주식, 리버 모어, CA, 미국 FO1 - 150
Isoflurane 마취 백스터 조제학, 디어 필드, IL 1001936060
직선 SuperCut 이리스 가위, 수술 도구 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 14,218
Vannas 마이크로 가위, 직선 수술 도구 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 14,003
더몬트 좋은 팁 포셉 수술 도구 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 503290
선박 클립 수술 도구 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 14,120
고주파 건조기 900 수술 도구 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 500397
7-0 외과 나일론 monofilament의 봉합 봉합하다 Ethicon, 주식 회사, 서머빌, 뉴저지, 미국 1647G 폐색에 대한 봉합
7-0 외과 실크 봉합 봉합하다 Ethicon, 주식 회사, 서머빌, 뉴저지, 미국 7733G 결합에 대한 봉합
실리콘 RTV 접착제 실리콘 고무 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 1571
Vetbond 조직 접착제 3M 회사, 세인트 폴, 미네소타, 미국 70200746587
Puralube 베트 연고 아이 연고 Pharmaderm, 멜빌, NY, 미국
Buprenorphine hydrochlorode 진통제 Hospira 주식 회사, 레이크 포레스트, IL, 미국 NDC 0409-2012-32
열 소작 단위 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 501292
PeriFlux 시스템 5000 TCD flowmetry Perimed, 스톡홀름, 스위든
BAT - 12 직장 온도계 세계 정밀 계측기, 주식 회사, 사라소타, 플로리다, 미국 BAT - 12R
T / 펌프, TP600 열 담요 Gaymar, NY, 미국
2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화 시약 시그마 - 알드리치 (주), 세인트 루이스, MO, 미국 T8877
마우스 뇌 매트릭스 슬라 이서 브레인 슬라 이서 Zivic - 밀러 연구실., 주식 회사, 앨리슨 공원, PA, 미국 BSMAS001 - 1

참고문헌

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  9. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
  10. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
  11. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
  12. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).

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