방법 논문

높은 처리량 현장에서 하이브리드화 방법

DOI:

10.3791/2912

⸱

2011년 8월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Biosciences, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin-Madison

이 논문에서

요약

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여기, 우리는 효율 높은 처리량을 설명 현장에서 하이브 리다이 제이션 (봐야죠) 방법입니다. 방법은 쉽게 다른 마우스 조직에서 또는 다른 종 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하기 위해 적용할 수 있습니다.

초록

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낮은 urogenital 트랙트 (LUT)의 개발은 복잡한 프로세스입니다. 이 복잡 androgenic 신호와 상피 - mesenchymal 상호 작용의 1,2에 의존 태아 남성 요도에서 전립선 형성하는 동안 입증합니다. 전립선 개발을 담당하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 부적절 같은 양성 전립선 증식과 전립선 암 등 전립선 질환을 야기할 나중에 삶에 reawakened 아르 성장 메커니즘을 보여줄 수 있습니다.

개발 LUT는 해부학적인 몸의 구조도 복잡합니다. 신진 시간 전립선은 16.5 일 게시 개념 (DPC)에 시작하여 많은 세포 유형이 존재한다. Vasculature, 신경 및 평활근은 mesenchymal 기질 내에 3. 이 기질은 multilayered 상피와 주변 androgen 수용체 의존 paracrine 신호 4 태아 전립선에 상승을 제공합니다. stromal androgen의의 신분 수용체 - 응답 전립선 개발 및 이들 유전자에 대한 응답으로 전립선의 상피 ductal 형태가 완전히 이해되지하는 메커니즘에 필요한 유전자. 정확하게 세포 유형을 식별하고 그들 내의 특정 요소의 표현을 집중하는 능력은 더욱 전립선 개발을 이해하는 필수적입니다. 원위치 하이브리드화 년 (이쉬) 조직 내에서 mRNAs의 국산화에 대한 수 있습니다. 따라서이 방법은이를 통해 잠재적인 전립선 개발 규제를 elucidating, 패턴 및 신호 분자와 그 수용체의 표현의 타이밍을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

여기, 우리는 진동 마이크로톰 - 컷 섹션을 사용하여 태아 마우스 LUT의 mRNA 발현 패턴을 식별하는 높은 처리량 이쉬 기술을 설명합니다. 이 방법은 다른 이쉬 프로토콜을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다. 슬라이드을 준수 얇은 섹션에 이쉬 수행하는 것이 기술적으로 어렵습니다, 모두 cryosections 및 파라핀 섹션은 종종 약한 신호 해상도로 결과를하면서 cryosections 자주 가난한 구조 품질을 가지고 있습니다. 전체 마운트 조직에 이쉬 수행하면 프로브 트래핑이 발생할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 높은 처리량 기술은 세부 조직 아키텍처를 공개 두꺼운 상처 부분을 활용합니다. 수정 microfuge 튜브는 이쉬 절차를 수행하는 동안 부분을 쉽게 처리하실 수 있습니다. 4 mRNA의 성적의 최대함으로써 비용과 효율성 극대화를 줄이고, 최대 단일 실행에서 검색된 24 mRNA의 성적을 가진 단일 17.5dpc LUT에서 심사하실 수 있습니다. 이 방법은 여러 치료 그룹 따라서 해석 데이터에 대한 모든 편견을 제거, 동일하고 하나의 단위로 처리할 수 있습니다. 대부분의 pertinently 전립선 연구원이 방법은 전립선 ductal 네트워크에 상승을 제공 태아 쥐 요도의 낮은 높은 어번던스 mRNA의 성적의 공간과 시간적 위치를 제공합니다.

프로토콜

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1. PCR 생성 템플릿에서 Digoxigenin - 11 - UTP - 라벨 Riboprobe의 합성

  1. 유전자 특정 riboprobe을 합성하기 위해 유전자 cDNA 참조 시퀀스 (RefSeq)을 구하는 Entrez 진 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)를 사용합니다. cDNA 시퀀스의 3' - 지역에 대한 유전자 특정 PCR의 primers를 디자인하는 Primer3 프로그램 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5를 사용합니다. PCR 프라이머 선택에 대한 권장 매개 변수는 (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html) 다른 곳으로 설명되어 있습니다.
  2. 선택한 DNA 순서의 특이성을 평가하기 MegaBLAST 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6를 사용합니다. 0.01의 기대 임계값을 사용하는 경우, DNA 시퀀스는 특정 간주됩니다, 그것은 RefSeq 데이터베이스에있는 다른 시퀀스와 일치하지 않습니다.
  3. PCR은 riboprobe ....

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토론

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방법을 사용하면 여기에 설명된, 그것은 주요 세포 유형 및 mesenchymal 패드, urothelium, 부드러운 근육, 전립선 꽃봉오리, ejaculatory 덕트 및 질을 포함하여 태아 남성과 여성의 마우스 LUTs의 조직 구획의 모든 mRNAs를 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 50μm 섹션은 조직 구조 (예 : 혈관 등) 해결하기 위해 충분한 두께가되는 장점을 가지고 있지만 일반적으로 전체 마운트 이쉬 동안 발생한 방법론 문제 프로브 트래핑을 피할 정도로 얇은 있습니다. 얼룩이 이전의 출판 연구 평가되어 어디에 모든 새로운 riboprobe은 긍정적인 제어 조직에 부과됩니다. 우리는 얼룩 패턴이 조직에있는 특정 있는지 확인합니다. 우리의 방법의 또 다른 장점은 여러 mRNAs의 패턴이 동일한 LUT 조직에서 인접 조직 섹션에 평가 될 수있다는 것이다. 또한,이 방법은 세포 특정 단백질 마커를 시각화하고 이쉬 프로토콜 스테인드 셀 형식을 식별하는 immunohistochemical 기법 결합 수 있습니다........

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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저자는 조직 바구니 준비에 기술 지원을위한 닥터 란 이순신, 뉴저지의 암 연구소, 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 DK083425 및 DK070219 국립 연구소에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
방지 Digoxigenin 항체, 팹 조각 로체 응용 과학 11214667001
시약 차단 로체 응용 과학 11096176001
BM 퍼플 AP 기판, precipitating 로체 응용 과학 11442074001
소 혈청 알부민 피셔 사이 언티픽 BP1600 - 100
세포 배양 플레이트,도 24 코닝 3524
Digoxigenin 11 - UTP 로체 응용 과학 1277073910
dNTPs 로체 응용 과학 11969064001
양날 면도날 윌킨슨 소드 클래식 모델
Eliminase RNase의 제거 Decon 연구소 1102
포름 아미드 시그마 F5786 - 1L
겔 추출 키트 Qiagen 28,704
H 2 O에서 글루 타 알데히드, 25 % 용액 시그마 G6257 - 100ML
헤파린 나트륨 소금 시그마 H3393
H 2 O에서 과산화수소, 30 % 용액 피셔 사이 언티픽 BP2633 - 500
Levamisole 시그마 L9756
Loctite 404 빠른 설정 인스턴트 접착제 헨켈 주식 회사 46,551
마그네슘 염화물 피셔 사이 언티픽 M33 - 500
Maleic 산성 시그마 M0375 - 500G
Microcentrifuge 튜브, 1.5mL Biologix 리서치 회사 BP337 - 100
Millicell 문화 플레이트 삽입 Millipore PICM01250
분자 분쇄 수지 G - Biosciences 786 - 138PR
인산염의 Paraformaldehyde, 4 %의 솔루션을 살린 버퍼 Affymetrix 19,943
인산은 칼슘 & MG없이 살린 버퍼 MP의 Biomedicals ICN1760420
폴리에스터 메쉬, 33 미크론, 12 "X 24" 소형 부품 부동산 CMY - 0033 - D
Proteinase K 용액, 20mg/ml Amresco E195 - 5ML
QIAshredder 열 Qiagen 79,654
Q 솔루션 Qiagen DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 함께 제공
RNase 시그마 R6513
RNase 저해제 로체 응용 과학 03335399001
RNeasy 미니 키트 Qiagen 74,104
RNEASY 미니 키트 Qiagen 74,104
RQ1 RNase없는 DNase Promega M6101
SeaPlaque 낮은 용융 아가로 오스 Lonza 50,101
양 혈청 시그마 S2263 - 500mL
Stericup 필터 유닛, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL Millipore SCGPU05RE
나트륨 azide, 입상 피셔 사이 언티픽 S227I - 100
나트륨 염화물 피셔 사이 언티픽 BP358 - 212
나트륨 dodecyl 황산 피셔 사이 언티픽 S529 - 500
SSC, 20X 솔루션 연구 제품 국제 S24022 - 4000.0
윗첨자 III 첫 스트랜드 합성 시스템 Invitrogen 18080-051
T7 RNA 효소 로체 응용 과학 10881767001
DNA 형성 촉매 DNA 중합 효소 Qiagen 201203
트리스 - HCL 피셔 사이 언티픽 BP153 - 1
트윈 20 피셔 사이 언티픽 BP337 - 100
고급 표본 욕실 마이크로톰 진동 Leica 마이크로 시스템즈 VT1000A
효모 tRNA 로체 응용 과학 109495

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
  2. Cunha, G. R.

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