I denna artikel presenterar vi en enkel, praktisk teknik för cerebrovaskulära gjutning som är lätt att utföra och kan utnyttjas för att bilden vaskulära trädet av den vuxna musen hjärnan.
Blodkärl avbildning är avgörande i den kliniska diagnosen och hantering av cerebrovaskulära sjukdomar som hjärnan kärlmissbildningar (BAVMs). Djurmodeller är nödvändiga för att studera etiopathology och möjlig behandling av cerebrovaskulära sjukdomar. Imaging kärlsystemet i stora djur är relativt lätt. Dock utvecklar fartyg avbildningsmetoder för musmodeller hjärnsjukdom önskvärt på grund av kostnaderna och tillgången på genetiskt modifierade möss linjer. Imaging de murina cerebral vaskulär träd är en utmaning. Hos människor och större djur, den gyllene standarden för att bedöma angioarchitecture på makrovaskulär (konduktans) nivå är x-ray kateter kontrast-baserad angiografi, en metod som inte lämpar sig för små gnagare.
I denna artikel presenterar vi en metod för cerebrovaskulär gjutning som ger en slitstark skelett av hela kärlbädd, inklusive artärer, vener och kapillärer som kan analyseras med hjälp av många different modaliteter. Komplett gjutning av mikrokärl av musen cerebrovasculature kan vara svårt, men är dessa utmaningar behandlas i detta steg-för-steg-protokollet. Genom intrakadriell perfusion av vaskulära gjutning material, alla fartyg i kroppen gjutna. Hjärnan kan då tas bort och förtydligas med hjälp av organiska lösningsmedel metylsalicylat. Tredimensionell avbildning av fartygen hjärnan blodet kan visualiseras enkelt och billigt med konventionella brightfield mikroskop eller dissekera mikroskop. Den gjutna cerebrovasculature kan också avbildas och kvantifieras med hjälp av mikro-datortomografi (mikro-CT) 1. Dessutom, efter att avbildas kan gjuten hjärnan vara inbäddade i paraffin för histologisk analys.
Fördelen med detta vaskulär gjutmetod jämfört med andra tekniker är dess breda anpassning till olika analytiska verktyg, inklusive brightfield mikroskopisk analys, datortomografi på grund av den röntgentäta egenskaperteristic av materialet, samt histologiska och immunhistokemiska analyser. Denna effektiv användning av vävnad kan rädda djur användning och minska kostnaderna. Vi har nyligen visat tillämpning av denna metod för att visualisera den oregelbundna blodkärlen i en musmodell av vuxna BAVM på en mikroskopisk nivå 2, och ge ytterligare bilder av missbildade fartyg avbildas av mikro-CT. Även denna metod har nackdelar och kanske inte idealisk för alla typer av analyser, är det en enkel, praktisk teknik som lätt kan läras och i stor utsträckning för vaskulär gjutning av blodkärlen i hela kroppen.
Vi redovisar här en metod för gjutning av vuxna musen cerebrovasculature som kan vara avbildade med olika modaliteter. Tillämpningen av denna metod för att sjukdomen modell BAVM möjliggör 3D-analys av oregelbunden fartyg. Potentiella framtida studier inkluderar kvantifiering av mikro-CT-bilder, histologisk analys av vävnader, och diagnos av vaskulär sjukdomsprogression.
Vanliga Problem och förslag
Komplett genomblödning av hjärnan kärlsystemet är inte alltid uppnås. Efter att ha tillräckligt tryck för att nå den distala blodkärl utan att sprängas sönder vänster förmak eller kroppspulsådern är en utmaning. För att lösa detta, tillämpas konsekvent tryck på ca 100 mm Hg. Också, justera nålen för att säkerställa lämplig utflöde av gjutning agent i aorta. Det är viktigt att halspulsåder inte är begränsade så att gjutningen agent kan nå hjärnan fartyg. Kritiska rutiner som korrelerar med förbättrad små fartyg perfusion är: (1) korrekt clearing av blodet från kärlsystemet, (2) filtrering av gjutning ombud, och (3) nål placering under gjutningen agent injektion. Försiktighet bör vidtas för att undvika injektion av casting agent in i vänster förmak och lunga. Andra forskare har framgångsrikt perfusion mus 3 och råtta 4 cerebrovasculature utan ytterligare förfaranden. Manuell analys av Microfil perfusion fartyg counterstained med hemotoxylin visade 93% fartyget lumen perfusion 5. Alltid kasta eller helt ren något verktyg som kommer i kontakt med casting agenten som det kommer polymeriserar snabbt och verktyg kan inte användas för flera ämnen. Förtydligande av den omgivande musen hjärnvävnad kan vara en utmaning. Efter nedsänkning i metylsalicylat kan vävnaden verkar fortfarande oklara, vilket gör fartyget avbildning svårt. Säkerställa god uttorkning och förtydligande bör lösa detta problem. Placering hjärnvävnad på en rocker under alkohol och metyl salicylate behandling kan förbättra vävnad förtydligande.
Nackdelar med tekniken
Begränsningarna av denna teknik är: (1) är det nödvändigt att injicera lösningen casting agenten omedelbart efter blandning det som det kommer tjocknar snabbt efter katalysatorn läggs, (2) gjutning agenten fyller stora konduktans fartyg lätt, men inte tillförlitligt fylla mindre fartyg, som arterioler (motstånd fartyg) och kapillärer (närande fartyg), och (3) det är inte den bästa röntgentäta kontrast för mikro-CT, men vissa grupper föredrar Microfil för mikro-CT 1,6. Efter förslagen föreslås ovan, inklusive korrekta nål placering, båtens position och perfusion tryck, kan slutföra gjutning av mindre fartyg uppnås. Den anpassningsförmåga till olika analysverktyg gör detta agenten ett värdefullt verktyg för att analysera cerebrovaskulära struktur, inklusive arteriella och venösa cirkulationen, med olikaperspektiv.
Tillämpningar av tekniken
Fördelen med denna metod är dess breda tillämpning potential. Den gjutna fyller alla fartyg, inklusive artärer, vener och kapillärer av alla vävnader i kroppen, så vaskulära strukturer i flera organ av olika arter kan analyseras. Tidigare har andra grupper använt denna perfusion för stora 7 och små 8 fartyg i humant, apa 9, får 10, råtta 4,11,12 och mus 3,13. Vi visar nu tecken på att använda denna teknik för att analysera strukturen av mikrokärl i musen hjärnan, både hos friska och vid olika sjukdomar 2. Dessutom finns det Microfil lösningar med olika viskositet tillgängliga för BEGJUTA fartyg av olika storlekar och olika färger för att förbättra visualisering av fartyg i olika organ. Exempelvis kan röda enkelt visualiseras i den bleka hjärnparenkymet och gult kontrasterar väl medmörkröd hjärtmuskeln. Eftersom materialet är röntgentäta kan kärlsystem avbildas med mikro-CT scanning för att få en 3D-roterande bild. Vävnaden kan även användas för paraffin och histologiska analys efter som avbildas.
Slutsats
Vi visar här ett protokoll för att göra en vaskulär avgjutning av blodkärlen i den vuxna musen hjärnan, som kan anpassas med hjälp av olika analysmetoder för att studera morfologiska struktur cerebrovasculature. Vi har också lagt fram bevis för tillämpningen av denna metod för att en modell av BAVM sjukdomstillstånd, företrädd av förstorad, oregelbundet formade fartyg som shunt blod från arteriella till venös upplagor. Det finns en mängd olika vaskulär gjutning metoder som finns tillgängliga. Den enkla Protokollet ger vi här för en vaskulär gjutna kan användas som ett verktyg för att undersöka kärlsystemet av den vuxna musen hjärnan med hjälp av olika avbildningsmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Voltaire Gungab för hjälp med manuskriptet förberedelser. Detta arbete stöddes delvis med bidrag från: National Institutes of Health (T32 GM008440 att EJ Walker, R01 NS27713 till WL Young, P01 NS44155 till WL Young och H. SU) och R21 NS070153 till H. Su, och den amerikanska Heart Association (AHA 10GRNT3130004 till H. SU).
Name | Company | Catalogue number | Notes |
Microfil | FlowTech, Inc. | MV130 | 4 month shelf life |
Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |