인터루킨-10 결핍 마우스에서 분변 미생물군 이식의 효과 평가

초록

출처: Xiao, Y. et al., 인터루킨 10 결핍 마우스 모델에서 대변 미생물군 이식의 치료 평가.J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오는 결장 염증이 있는 인터루킨-10 결핍 마우스의 대변 미생물군 이식 절차를 보여줍니다. 장내 집락화된 대변 미생물은 2차 대사 산물을 방출하여 항염증성 사이토카인 방출을 유도하고 대장 염증을 감소시킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 신선한 배설물 알갱이 수집

1. 멸균 종이 타월, 뭉툭한 집게, 50mL 원뿔형 튜브를 준비합니다.
   1. 종이 타월과 집게를 별도의 오토클레이브 백에 넣고 180°C에서 건열에서 30분 동안 고압증기멸균합니다. 멸균 원추형 튜브도 사용하십시오. 원뿔형 튜브의 무게를 측정하고 튜브에 무게를 기록합니다.
2. 동물실의 생물 안전 캐비닛을 켭니다.
3. 침구가 없는 고압멸균된 깨끗한 마우스 케이지를 가져다가 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 덮개와 식품 선반을 제거하고 캐비닛 안에 넣으십시오.
4. 케이지 바닥에 멸균 종이 타월을 놓고 케이지 위에 금속 랙을 다시 놓습니다.
5. 연령이 일치하는 대변 기증자를 식별하고 마우스 케이지를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 케이지를 열고 기증자 마우스(C57BL/6J)의 꼬리를 부드럽게 잡고 깨끗한 케이지 상단의 금속 랙에 놓습니다.
6. 케이지 덮개를 랙 위에 놓고 동물이 배변할 때까지 기다립니다.
   참고: 랙에 마우스 리터메이트 몇 개를 동시에 놓습니다.
7. 배설물 펠릿을 모아 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 펠릿을 성별로 모으십시오. 수컷과 암컷에서 채취한 배설물을 혼합하지 마십시오.
8. 튜브의 무게를 다시 측정하고 배설물 알갱이의 무게를 계산합니다.

2. 분변 현탁액의 준비

1. 멸균 용액(생리 식염수 중 10% 글리세롤)을 준비합니다.
2. 대변 펠릿 1g당 원뿔형 튜브에 10% 글리세롤/생리식염수 10mL를 추가합니다.
   참고: 필요한 경우 용액 부피를 20mL로 늘립니다. 이 연구에서는 각 펠릿(5-10mg)에 대해 1mL의 용액도 사용했습니다.
3. 벤치탑 균질화기 또는 흄 후드 내부의 블렌더를 사용하여 저속으로 혼합물을 균질화하여 대변을 다시 부유시킵니다(3 X 30초).
4. 2겹의 멸균 면 거즈(10.2cm x 10.2cm)를 통해 분변 현탁액을 걸러냅니다. 여과액을 냉장고에 최대 6시간 동안 임시로 보관하거나 멸균 극저온 바이알에 포장하여 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
5. 표준 절차에 따라 균질기 또는 블렌더를 철저히 청소하십시오.

3. 구강 배기에 의한 대변 현탁액 투여

1. 냉동 샘플을 사용하는 경우 얼음 위에서 얼어붙은 배설물 현탁액을 해동합니다. 해동된 배설물 현탁액을 볼텍싱(vortexing)으로 혼합합니다.
2. 신선하거나 해동된 분변 현탁액을 1mL syringes.
   로 옮깁니다. 참고: 각 마우스는 총 200μL의 분변 현탁액을 투여받고, 대조군의 각 IL-10^-/- 마우스는 200μL의 10% 글리세롤/생리식염수를 투여합니다.
3. 마우스의 무게를 측정하고 올바른 개비지 바늘 크기와 최대 투여량을 선택합니다.
   알림: 체중이 20-25g 사이인 마우스의 경우 20mm 볼이 있는 3.81G 2.25cm 곡선 간 바늘을 사용합니다. 자세한 내용은 gavageneedle.com 확인하시기 바랍니다.
4. 쥐의 코 끝에서 xiphoid process(흉골 하단)까지의 길이를 측정하여 gavage 바늘을 테스트합니다. 주사기에 10% 글리세롤/식염수 또는 분변 현탁액을 채우고 주사기와 바늘 내부의 기포를 제거합니다.
   알림: 바늘이 길이보다 길면 코 높이의 바늘 샤프트/튜브에 표시를 하십시오. 위 천공을 방지하기 위해 그 지점을 지나 동물을 통해 바늘/튜브를 통과시키지 마십시오.
5. 생물 안전 캐비닛에 마우스 케이지 하나를 놓고 플라스틱 케이지 덮개를 제거한 다음 금속 랙을 제자리에 둡니다.
6. 마우스 한 마리의 꼬리를 잡고 금속 선반에 올려 놓습니다. 한 손으로 쥐의 꼬리를 잡고 다른 손의 엄지와 중지를 사용하여 어깨 너머의 피부를 움켜쥐어 동물을 제지합니다. 이렇게 하면 앞다리가 옆으로 뻗어 앞발이 바늘을 밀어내는 것을 방지할 수 있습니다. 동물의 머리를 부드럽게 뒤로 뻗고 한 손으로 머리를 제자리에 잡습니다.
   참고: 실험을 진행하기 전에 실험자가 완전히 자신감을 가질 때까지 마우스 다루기를 연습하십시오.
7. 입 안의 혀 위에 간침을 놓습니다. 바늘이 식도에 도달할 때까지 위쪽 입천장을 따라 부드럽게 전진합니다. 한 번의 동작으로 바늘을 부드럽게 통과시킵니다. 저항이 느껴지면 바늘에 힘을 가하지 마십시오. 바늘을 빼고 다시 시도하십시오.
8. 바늘이 제대로 배치되고 확인되면 바늘에 부착된 주사기를 밀어 재료를 천천히 투여합니다. 식도를 파열시킬 수 있으므로 바늘을 돌리거나 바늘을 앞으로 밀지 마십시오. 투여 후 바늘을 부드럽게 당겨 빼냅니다.
9. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다. 호흡 곤란이나 고통의 징후를 찾아 5-10분 동안 동물을 모니터링합니다. FMT 후 12-24시간 사이에 마우스를 다시 모니터링합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD 주사기, 1 mL	피셔 사이언티픽	14-829-10층
무딘 끝 집게	크나이프스	926443
C57BL/6J 마우스	잭슨 랩	664
원심 분리기	에펜도르프	5415R
원뿔형 튜브	써모피셔	339650
곡선 공급 바늘	켄트 사이언티픽	FNC-20-1.5-2
글리세롤	밀리포어시그마	G5516
IL-10 녹아웃 마우스	잭슨 랩	4366
USP 생리식염수	그레인저	6280
기화 기	안락사 Corp.	이지-108SA

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