인간 신경전구세포를 뉴런으로 분화시키기 위한 공동 배양 기술

초록

출처: Su, C. T. E., et al. 공동 배양 시스템에서 신경 연결 형성을 평가하기 위한 광유전학적 접근. J. Vis. 특급 (2015).

이 동영상은 인간 신경전구세포(NPC)를 뉴런으로 분화하는 방법을 보여줍니다. NPC는 확립된 마우스 성상세포-쥐 피질 뉴런 공동 배양에 도입되어 NPC가 뉴런으로 분화되는 것을 촉진합니다. 분화는 컨포칼 현미경으로 세포를 시각화하여 확인됩니다.

프로토콜

1. 유도만능줄기세포의 생성

1. 6-well plates에 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM의 배양 인간 섬유아세포.
2. 섬유아세포의 재프로그래밍을 시작하기 전에 6-well을 Matrigel로 코팅하고 실온에서 최소 한 시간 동안 배양합니다. 80% confluence에서 섬유아세포 배양에서 배지를 제거하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척합니다.
3. 플레이트 전체를 덮을 수 있도록 충분한 0.25% 트립신-EDTA를 첨가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
4. 세포가 웰에서 빠져나오면 트립신 소화를 억제하기 위해 트립신보다 10% FBS가 함유된 DMEM의 두 배를 첨가합니다. 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분해합니다. 혈구계(hemocyometer)로 단일 세포의 수를 세십시오.
5. 7 x 10⁵ 세포를 15ml 원심분리 튜브로 옮기고 200 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
6. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 전기천공법(electroporation) 용액에 재현탁시킵니다. 제조업체의 지침에 따라 섬유아세포를 전기천공합니다. 100μl의 electroporation buffer에 세포를 재현탁하고 각 episomal vector를 1μg씩 추가합니다. 1,650V, 10ms 및 3시간 펄스 설정으로 셀을 전기천공합니다.
7. 세포 현탁액을 10% FBS가 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)으로 옮기고 6웰 플레이트의 웰당 5 x 10⁴ 세포를 플레이트화합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 플레이트를 배양합니다.
8. 48시간 후, 형질주입된 섬유아세포 배양물에서 배지를 제거하고 mTeSR 배지로 교체합니다. 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 콜로니를 분리할 준비가 될 때까지 배양 배지를 매일 교체하십시오. iPSC 집락은 28-35일 후에 관찰할 수 있습니다.
9. 분리 준비가 되면 iPSC 콜로니를 기계적으로 절단하고 10μM Rho-associated protein kinase(ROCK) 억제제(Y-27632)가 포함된 mTeSR 배지를 Matrigel 코팅된 6웰 플레이트에 다시 시딩합니다. 배양 배지를 매일 교체하십시오.

2. 인간 NPC의 신경 유도 및 유지

1. iPSC 배양이 약 20% confluence인 경우 mTeSR 배지를 제거하고 신경 유도 배지로 교체합니다. 이틀에 한 번씩 배지를 보충하십시오.
2. 7일 후 신경 유도 매체를 제거하고 인간 NPC 유지 매체로 교체합니다. 배양액을 전달하기 최대 7일 전까지 2일마다 배지를 보충하십시오.
3. 배양을 계대 건조하기 전에 Matrigel로 플레이트/플라스크를 실온에서 최소 1시간 동안 코팅합니다.
4. 융합 인간 NPC 배양에서 배지를 제거하고 1x PBS로 한 번 세척한 다음 PBS를 흡인합니다.
5. 모든 웰을 덮을 수 있을 만큼 충분한 세포 분리 용액을 추가한 다음 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
6. 모든 셀이 분리되었는지 확인합니다. DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)의 두 배를 세포 분리 용액의 양으로 웰/플라스크에 첨가합니다.
7. DMEM/F-12가 포함된 세포를 15ml 원심분리 튜브로 옮기고 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
8. 상층액을 제거하고 5ml 인간 NPC 유지 배지에서 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분해합니다.
9. 전체 세포의 1/3을 Matrigel 코팅된 배양 웰/플라스크에 플레이트링하고 10μM Y-27632가 보충된 충분한 배지를 채웁니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 배양 용기를 배양합니다.
   1. 3-4일마다 배양액을 1:3으로 나누고 격일로 배지를 보충합니다. 분화를 방지하기 위해 인간 NPC 배양을 고밀도로 유지합니다.

3. 공동 배양에서 인간 NPC를 뉴런으로 분화

1. 뉴런으로의 분화를 시작하기 전에 렌티바이러스 벡터인 Synapsin1-tdTomato를 인간 NPC 배양에 추가합니다. 인간 NPC를 분화하기 하루 전에 성상세포/피질 뉴런 공동 배양을 준비합니다.
2. 인간 NPC 배양액을 1x PBS로 한 번 세척하고 모든 웰/플라스크를 덮을 수 있을 만큼 충분한 세포 분리 용액을 첨가한 다음 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
3. 모든 셀이 분리되었는지 확인합니다. 세포 분리 용액의 두 배인 DMEM/F-12를 웰/플라스크에 첨가합니다. 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 200 x g에서 5분 동안 원심분리기
4. 상층액을 제거하고 5ml 신경 분화 배지에서 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫으로 분사하여 세포 펠릿을 단일 세포로 분해합니다. 혈구계(hemocyometer)로 단일 세포의 수를 세십시오.
5. 성상세포/피질 뉴런 배양에서 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 각 24-well에 대해 10μM Y-27632가 보충된 500μl의 신경 분화 배지에서 5 x 10³ cells/cm²의 플레이트 인간 NPC. 성상세포와 피질 뉴런을 방해하지 않도록 각 웰에 인간 NPC가 포함된 배지를 부드럽게 추가합니다.
6. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 플레이트를 배양합니다. 배지의 절반을 최소 28일 동안 2-3일마다 새 배지로 교체하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Epi5 Episomal iPSC 리프로그래밍(Reprogramming) 키트	인비트로젠	A15960
DMEM/F12	론자	12719F
마트리겔	BD 바이오사이언스	354277
Neurobasal 배지	인비트로젠	21103049
증권 시세	시그마	A7906
PBS (PBS)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	SH30028.02
15ml 원심분리기 튜브	BD 바이오사이언스	352096
트립신-EDTA	인비트로젠	25200056
50ml 원심분리기 튜브	BD 바이오사이언스	352070
24웰 플레이트	코 닝	9761146
6웰 플레이트	코 닝	720083
T25 플라스크	코 닝	430641
Neon Transfection 시스템	인비트로젠	MPK5000	인간 섬유아세포의 전기천공법용
정상 피부 인간 섬유아세포	프로모셀	C12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE	애드진	20945

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