방법 논문

Calcium Imaging in individual neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 알을 낳는 행동을 조절하는 개별 뉴런의 칼슘 이미징)

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Ravi, B. et al., Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 유전적으로 암호화된 형광 리포터 단백질을 사용하여 행동하는 Caenorhabditis elegans의 개별 뉴런에서 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. 이 연구는 기생충의 움직임을 이미징하고 뉴런에서 리포터 형광 비율을 측정하여 세포 내 칼슘 수치를 알을 낳는 동안 뉴런 활동 및 행동 변화와 상관시키는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

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1. 동물의 변형, 배양 배지 및 장착

  1. OP50 E. coli 박테리아 먹이를 파종한 표준 60mm 선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트에서 20°C에서 C. elegans 벌레를 성장시킵니다.
  2. 관심 세포 특이적 프로모터별로 두 개의 플라스미드를 준비합니다: 첫 번째는 세포 내 Ca2+를 기록하기 위해 GCaMP5의 발현을 유도하는 것이고, 다른 하나는 GCaMP5 형광 변화의 비율계량 정량을 허용하고 객체 검색 및 측정을 단순화하기 위해 mCherry의 발현을 유도하는 것입니다.
    메모: GCaMP5:mCherry 비율계량 이미징은 세포 내 Ca2+의 실제 변화가 아니라 초점과 동물의 움직임의 변화로 인한 GCaMP5 형광의 변동을 보정합니다.
  3. LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X 돌연변이 동물의 생식선에 pL15EK 가시광선 구조 마커 플라스미드와 함께 GCaMP5 및 mCherry 발현 플라스미드를 GCaMP5 및 mCherry가 아닌 Muv lin-15(+) 동물을 회수합니다. lite-1 돌연변이 배경을 사용하여 청색광 회피 동작을 줄입니다.
  4. 전이유전자를 염색체에 통합하여 모자이크를 줄이고 복합 돌연변이 균주의 생성을 단순화합니다.
    메모: 여기에 기술된 LX2004 균주는 nlp-3 promoter의 HSN에서 GCaMP5 및 mCherry를 발현하는 통합 high-copy 전이유전자를 운반합니다(Table of Materials(재료 표 참조). nlp-3 promoter는 테스트된 다른 promoter(예: tph-1, egl-6unc-86)에 비해 HSN 발달 또는 산란 행동에 심각한 결함을 일으키지 않고 후기 L4 및 성체 동물의 HSN에서 강력한 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 균주 및 복삭 (VC) 운동 뉴런, 외음부 근육 및 uv1 신경 내분비 세포에서 GCaMP5 및 mCherry를 발현하는 다른 균주는 Caenorhabditis Genetics Center에서 구할 수 있으며 그 구성에 대한 세부 정보가 설명되었습니다.
  5. 파종된 NGM 한천 플레이트의 OP50 박테리아 식품을 백금 웜 픽의 바닥에 바르고 이를 사용하여 nlp-3 프로모터의 HSN에서 GCaMP5 및 mCherry를 발현하는 ~ 20마리의 후기 L4 LX2004 동물을 옮깁니다. 발달 중인 외음부가 실체 현미경에서 흰색 초승달로 둘러싸인 투명한 어두운 점으로 나타나는지 확인합니다. 20 ° C에서 24-40 시간 동안 동물을 부화시킵니다.
  6. 배양 후 OP50을 픽에 바르고 ~ 3 마리의 벌레를 파종되지 않은 NGM 플레이트로 옮기고 이미징 중에 벌레가 먹을 수 있도록 소량의 음식을 남깁니다. 박테리아 먹이가 너무 적으면 벌레가 접시 중앙에서 멀어지게 되고 먹이가 너무 많으면 배경 형광이 증가하고 저산소증이 발생하므로 충분한 음식을 확보하십시오.
  7. 편평하고 둥근 주걱을 사용하여 웜이 들어 있는 플레이트에서 ~ 20mm x 20mm 덩어리를 자르고 덩어리를 앞면이 아래로 향하게 하여 깨끗한 24mm x 60mm #1.5 커버슬립의 중앙에 옮깁니다(그림 1). 기포가 커버슬립 아래에 갇혀 이미징을 방해하지 않도록 한쪽에서 응용 프로그램을 시작합니다. 덩어리 상단에 22mm x 22mm #1 커버슬립을 적용하여 고착과 증발을 줄입니다.

2. 하드웨어 및 계측 설정

  1. ≥ 0.7 Numerical Aperture Plan-Apochromat 20x 대물렌즈, 조이스틱, 이미지 스플리터, GCaMP5 및 mCherry 여기 및 방출을 동시에 위한 형광 필터로 제어 가능한 전동 XY 스테이지, 형광 및 적외선 명시야 이미징용 카메라, 트리거 가능한 발광 다이오드(LED) 조명 시스템(그림 2A)을 사용하여 병기된 형질전환 웜을 도립 현미경의 스테이지에 놓습니다(그림 2A).
    참고: 80/20 빔 스플리터는 이미지 신호의 80%를 형광 카메라로, 20%를 명시야 카메라로 보냅니다. 정립 현미경도 사용할 수 있지만 이 경우 NGM 덩어리를 유리 슬라이드와 대형 커버슬립 사이에 배치해야 합니다.
    1. 양안 접안렌즈를 사용하여 이미징을 위한 웜을 선택합니다. 동물을 선택하면 적외선 필터를 콘덴서 위의 제자리에 밀어 넣습니다.
  2. 트랜지스터-트랜지스터 로직(TTL) 트리거
    1. 형광 카메라의 3개 TTL 트리거 출력 라인 각각에서 동축 케이블을 연결합니다. 첫 번째 출력을 LED 조명 시스템의 BNC 입력 #3에 연결합니다.
    2. 적외선 카메라의 GPIO 입력 #8(핀 4) 및 접지(핀 5)로 각각 실행되는 8핀 GPIO 커넥터의 녹색 및 갈색 와이어가 있는 BNC '바나나' 어댑터에 두 번째 출력을 연결합니다.
    3. 세 번째 출력을 디지털 수집 장치의 #8 디지털 입력 및 접지로 연결되는 점퍼 와이어를 사용하여 BNC '바나나' 어댑터에 연결합니다(그림 2B).
  3. 디지털 수집 디바이스(DAQ)
    1. USB 케이블을 통해 DAQ 마이크로컨트롤러 보드(목차 참조)를 PC에 연결합니다. 표준 Firmata 프로토콜(목차 참조)로 펌웨어를 업데이트하고 57600 보드에서 통신하도록 USB 포트를 구성합니다.
  4. LED 표시등
    1. LED 컨트롤러 소프트웨어를 실행합니다(목차 참조). 트리거 모드를 '연속'에서 '게이트'로 전환하고 3 및 470nm LED 모두에 대해 트리거 채널 '590'을 선택합니다.
    2. 각 LED에 대해 LED 전원을 켜고 입력합니다(예: 470nm LED를 20%로, 590nm LED를 40%로 설정).
  5. 에서 Bonsai직렬 스테이지 통신 스크립트 'XY-stage-final'을 실행합니다( 재료 참조). 회색 'CsvWriter' 노드를 클릭하고 기록된 X 및 Y 스테이지 정보를 저장할 폴더를 선택합니다(그림 3). 툴바에서 녹색 화살표를 눌러 DAQ.
    를 초기화합니다. 메모: 스크립트는 형광 카메라가 TTL 신호를 보낼 때 X 및 Y 스테이지 위치를 기록하기 시작합니다. 이 스크립트는 프레임 번호, X 위치(μm), Y 위치(μm) 및 프레임 간 간격(s)의 4개 데이터 열을 출력합니다.
  6. 적외선 카메라 녹화 소프트웨어(재료 표 참조)의 '사용자 지정 비디오 모드'에서 "모드 1"(2 x 2 비닝, 1,024 x 1,024픽셀) 및 "Pixel Format Raw 8"을 선택합니다. '트리거/스트로브'에서 트리거 입력 라인(GPIO)을 "3"으로, 극성을 "높음"으로, '모드'를 "14"로 설정합니다. TTL 트리거 신호가 수신될 때까지 프레임 수집을 중지하려면 'Enable'을 토글합니다.
    1. 해당 창을 열어 둔 상태에서 기본 카메라 보기 도구 모음에서 빨간색 "녹화" 버튼을 클릭합니다. 이미지 시퀀스를 저장할 폴더를 선택합니다. '버퍼링' 녹화 모드를 선택하고 '이미지'를 JPEG 형식으로 저장합니다. "Start Recording(기록 시작)"을 클릭하여 획득을 초기화합니다.
  7. 형광 카메라 및 이미지 스플리터
    메모: 비율계량 정량을 위한 적절한 이미지 등록을 보장하기 위해 GCaMP5 및 mCherry 형광 채널을 동시에 수집해야 합니다. 이미지 스플리터를 사용하면 하나의 센서에서 GCaMP5 및 mCherry 형광을 2채널로 획득할 수 있습니다.
    1. 이미지 획득 소프트웨어(Table of Materials) 의 'Capture' 탭에서, 노출 시간을 10ms로, binning을 4x로, 이미지 깊이를 16비트로 설정합니다. 너비 512픽셀, 높이 256픽셀의 가운데 카메라 서브어레이를 선택합니다. 'Show Output Trigger Options'를 클릭하고 모든 트리거를 'Positive'로 설정합니다.
      참고: DAQ는 10ms 이하인 경우 TTL 트리거를 놓칠 수 있습니다.
    2. '트리거 1' 및 '트리거 2'는 '노출'로 설정되고 '트리거 3'은 '주기'가 25ms인 '프로그래밍 가능'으로 설정되어 있는지 확인합니다. 'Sequence' 탭에서 'Field Delay1'이 50ms인 'Time Lapse'를 선택하여 20Hz에서 이미지를 수집합니다. 'Save to Temporary Buffer'를 선택합니다.
  8. 3채널 컨포칼 이미징 중 PMT 게인 및 레이저 강도
    1. 배경 형광이 최소값(검은색 수준)보다 약간 높은 수준이 되도록 PMT 게인을 설정합니다. mCherry 채널의 시냅스전 말단에서 단일 포화 12비트 또는 16비트 픽셀이 관찰될 때까지 561nm(녹색) 레이저 출력을 높입니다.
    2. GCaMP5 형광이 배경 위의 시냅스전 말단에서만 보이도록 488nm(파란색) 레이저 강도를 조정합니다. 이 낮은 설정은 강한 Ca5+ 과도 현상에 대한 반응으로 형광이 증가할 때 GCaMP2 픽셀의 채도를 방지합니다. 컨포칼 핀홀을 끝까지 열어 빛 포착을 극대화합니다.

3. 비율계량 Ca2+ 이미징 및 행동 기록

  1. 형광 획득 소프트웨어의 'Sequence' 탭에서 "Start(시작)"를 클릭하여 기록을 시작합니다. 조이스틱으로 웜을 추적하여 관심 있는 세포와 시냅스를 초점과 시야각(FOV)의 중앙에 유지합니다. 히스토그램 창에서 '통계' 버튼을 클릭하면 각 채널의 픽셀 통계가 표시됩니다.
  2. ≥ 8,000 카운트(~ 4,000 광전자)의 시냅스전 말단에서 최대 단일 픽셀 mCherry 형광을 보장하도록 LED 전력을 조정하여 배경 위의 ~ 12비트 동적 범위(~ 100 광전자)를 제공합니다. 휴지기(낮음) Ca2+ 동안 시냅스전 말단에서 GCaMP5 신호는 약 ~ 2,500 카운트여야 합니다.
  3. 하나의 알을 낳는 활성 상태에 도달할 때까지 기록하십시오. 일반적으로 이것은 야생형 벌레에서 20-30분마다 발생합니다. 10분 분량의 하위 집합(12,001프레임), 첫 번째 알을 낳는 이벤트(프레임 6,001) 전후 6,000프레임을 저장합니다. 웜 동작의 명시야 이미지와 XY 스테이지 위치의 시점을 동일하게 유지해야 하며, 그렇지 않으면 데이터 스트림의 정확한 동기화가 손실됩니다.
  4. ImageJ 및 BioFormats 플러그인(재료 표 참조)을 사용하여 이미지 염기서열을 .ics(Image Cytometry Standard) 형식으로 변환하여 Ratiometric Quantitation 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.

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결과

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figure-results-1
그림 1. C. 알을 낳는 회로 활동 및 거동에 대한 고해상도 이미징을 위한 예쁜꼬마선충 장착 기술.상단, 측면에서 최종 마운트. 바닥, 큰 커버 슬립의 바닥을 통해 본 최종 마운트. 화살표는 NGM 한천 덩어리와 큰 24mm x 60mm 커버슬립 사이에 끼워진 OP50 박테리아 먹이, 예쁜꼬마선충 벌레 및 알을 나타냅니다.

figure-results-2
그림 2. Widefield ratiometric Ca2+ 이미징 및 ...

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C. elegans 성장, 재배 및 장착
대장균 세균 균주, OP50Caenorhabditis 유전자 센터오피50예쁜꼬마선충을 위한 음식. 우라실 auxotroph. 대장균 B. 생물 안전성 레벨 1
HSN GCaMP5+m체리 웜 균주Caenorhabditis 유전자 센터LX2004HSN에서 GCaMP5 및 mCherry 발현을 유도하기 위해 nlp-3 promoter를 사용하는 통합 transgene. 전체 유전자형 :
vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
LITE-1(CE314), LIN-15(N765TS) 전이유전자 준비를 위한 돌연변이 균주저자LX1832pL15EK lin-15(n765ts) 구조 플라스미드를 사용한 미세주입 후 high-copy 전이유전자 회수를 위한 균주. 또한 청색광 민감도를 감소시키는 연결된 lite-1(ce314) 돌연변이를 가지고 있습니다. 요청에 따라 작성자가 사용할 수 있습니다.
pL15EK lin-15a/b 게놈 구조 플라스미드저자pL15EKLX1832
에 주입 후 형질전환 동물 회수를 위한 구조 플라스미드 LITE-1(CE314), LIN-15(N765TS) X 변형률 요청에 따라 작성자가 사용할 수 있습니다.
pKMC299 플라스미드저자pKMC299nlp-3 promoter의 HSN에서 mCherry의 발현을 위한 플라스미드. nlp-3 3' 번역되지 않은 영역이 있습니다.
pKMC300 플라스미드저자피엠씨300nlp-3 promoter의 HSN에서 GCaMP5 발현을 위한 플라스미드. nlp-3 3' 번역되지 않은 영역이 있습니다.
인산칼륨 일염기성시그마P8281NGM 플레이트 준비용
인산칼륨 이염기성시그마P5655NGM 플레이트 준비용
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트암레스코662NGM 플레이트 준비용
Calcium Chloride Dihydrate (염화칼슘 이수화물)알파 에자르12312NGM 플레이트 준비용
펩톤벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)211820NGM 플레이트 준비용
소금암레스코241NGM 플레이트 준비용
콜레스테롤알파 에자르A11470NGM 플레이트 준비용
한천, 세균 유형 A, 초순수어피메트릭스10906NGM 플레이트 준비용
60mm 페트리 접시폭스바겐25384-164 NGM 플레이트 준비용
24 x 60mm 마이크로 커버 안경, #1.5폭스바겐제48393-251벌레를 이미지화하는 커버 유리
22 x 22mm 마이크로 커버 안경, #1폭스바겐제48366-067한천 덩어리의 상단을 덮는 커버 유리
투과광 베이스가 있는 실체현미경라이카M50벌레 변형 유지 관리, 스테이징 및 장착을 위한 해부 현미경
백금 이리듐 와이어, (80:20), 0.2mm알파 에자르AA39526-BW웜 전송용
칼슘 이미징 현미경
방진 에어 테이블티엠씨63-544Micro-g '랩 테이블 30 "x 48"진동 방지 테이블 (25mm 상단에 4 인치 CleanTop M6
도립 복합 현미경자이스431007-9902-000Axio Observer.Z1 도립 현미경
사이드포트 L80/R100(3위치)자이스425165-0000-000출력의 20%를 명시야(CMOS) 카메라로, 80%를 형광(sCMOS) 카메라로 전환
틸트 백 일루미네이션 캐리어자이스423920-0000-000적외선/행동 이미징용
램프 하우징 12V / 100W (콜렉터 포함자이스423000-9901-000적외선/행동 이미징용
할로겐 램프 12V/100W자이스전화: 380059-1660-000적외선/행동 이미징용. 백색광 LED는 상당한 적외선을 방출하지 않으므로 적외선 대역 통과 필터 후 명시야 이미징을 허용하지 않습니다
할로겐 램프용 32mm 적외선 대역 통과 필터(750-790nm)자이스447958-9000-000BP 750-790; DMR 32mm, 명시야 및 거동을 위한 적외선 조명용
6-필터 콘덴서 터렛(LD 0.55 H/DIC/Ph), 전동자이스424244-0000-000적외선/행동 이미징용
콘덴서 & 셔터자이스423921-0000-000적외선/행동 이미징용
적외선 CMOS 카메라용 광관이 있는 양안 접안렌즈자이스425536-0000-000적외선/행동 이미징용
접안렌즈 10x, 23mm자이스444036-9000-000한천 청크의 웜 현지화
C-마운트 어댑터 2/3" 0.63x 확대경자이스426113-0000-000적외선 CMOS 카메라용 마운트
적외선 명시야 및 동작을 위한 CMOS 카메라(1" 센서)FLIR(구 Point Grey Research)GS3-U3-41C6NIR-C명시야 이미징을 위한 카메라
USB 3.0 호스트 컨트롤러 카드FLIR(구 Point Grey Research)ACC-01-1202Fresco FL1100, 4포트
8핀, 1m GPIO 케이블, Hirose HR25 원형 커넥터 FLIR(구 Point Grey Research)ACC-01-3000TTL 트리거링용 케이블. 녹색 선은 GPIO3 / 핀 4에 연결되고 갈색 선은 접지 / 핀 5에 연결됩니다
플랜-아포크로맷 20x/0.8 WD=0.55 m27자이스420650-9901-000배율, 개구수 및 작동 거리의 최적 조합
6-큐브 리플렉터 터렛, 전동자이스424947-0000-000형광 이미징용
형광 라이트 트레인, 전동자이스423607-0000-000형광 이미징용
형광 셔터자이스423625-0000-000형광 이미징용
GFP 및 mCherry 이중 여기 및 방출 필터 큐브(현미경용)자이스제489062-9901-000FL 필터 세트 62 HE BFP+GFP+HcRed 형광 이미징용
LED 조명 시스템자이스423052-9501-000형광등 조명용 트리거 가능한 Colibri.2 LED 시스템
GFP LED 모듈(470nm)자이스423052-9052-000GFP 형광 여기를 위한 Colibri.2 LED
mCherry LED 모듈(590nm)자이스423052-9082-000mCherry 형광 여기를 위한 Colibri.2 LED
입사광 장비용 아이리스 스톱 슬라이더자이스000000-1062-360LED 조명을 카메라 시야로 제한하는 필드 조리개 조리개
C-마운트 어댑터 1" 1.0x자이스426114-0000-000이미지 스플리터 및 sCMOS 형광 카메라용 어댑터
이미지 분할하마마쓰A12801-01Gemini W-View, 다른 이미지 스플리터를 사용할 수 있지만 sCMOS 카메라의 큰 센서 크기에 최적화되지 않을 수 있습니다.
GFP / mCherry 이색성 거울 (이미지 스플리터)셈록디02-R594-25X36mCherry 및 적외선 신호에서 GCaMP5 분할
GFP 방출 필터(이미지 스플리터)셈록FF01-525/30-25GCaMP5 형광 캡처
mCherry/ 발광 필터(이미지 분할기)셈록FF01-647/57-25이 필터는 명시야 이미징에 사용되는 적외선을 제외하는 데 필요합니다
형광용 sCMOS 카메라(1" 센서)하마마쓰A12802-01 / C11440-22CU오르카 플래시 4.0 V2. 최신 모델은 센서의 개별 절반에서 별도의 이미지 획득 설정을 허용하여 이미지 스플리터와 함께 2채널 이미지를 획득할 수 있습니다
전동 XY 스테이지메르자흐호이저IM 130 x 100 스캔스테이지 이동; 이 스테이지의 XY 해상도는 스텝당 0.2μm입니다
XY 스테이지 컨트롤러(조이스틱 포함)러들MAC6000, XY 조이스틱웜의 수동 추적. MAC6000 컨트롤러는 232 보드로 구성된 직렬(RS-115200) 포트를 통해 PC에 연결해야 합니다
디지털 수집 보드(DAQ)아두이노우노sCMOS 카메라에서 TTL 트리거를 수신합니다. Uno는 표준 Firmata 패키지와 함께 로드되어야 하며 컴퓨터 USB 포트는 57600 보드로 구성되어야 합니다.
BNC 수-BNC 수 케이블 - 6피트호사 테크놀로지호브6TTL 트리거링용 BNC 커넥터
금도금 BNC Male - SMA 수 동축 케이블(8.8")UXCELL6.08642E+11형광 카메라 트리거 출력을 연결하려면
BNC 턴 헤드 어댑터한텍RRBNCTH21BNC-바나나 플러그 어댑터(4mm)
BNC 암-암 커넥터디아엡20130530009카메라의 BNC 출력을 바나나 플러그에 연결하기 위한 암-암 BNC 어댑터
무납땜 유연한 브레드 보드 점퍼 와이어지&티GK1212827BNC 트리거 출력을 Arduiono DAQ에 연결합니다. 수에서 수로.
고성능 워크스테이션마방Z820Windows 7, 64GB RAM, 듀얼 제온 프로세서, 솔리드 스테이트 C: 드라이브, 직렬(RS-232) 포트, 이더넷 연결을 위한 여러 PCIe3 슬롯, USB 3.0 카드 및 추가 솔리드 스테이트 드라이브
M.2 솔리드 스테이트 드라이브삼성MZ-V5P512BW이미지 데이터의 고속 스트리밍 및 분석
워크스테이션용 M.2 솔리드 스테이트 드라이브 어댑터라이콤DT-120M.2 - PCIe 3.0 4레인 어댑터
네트워크 연결 스토리지시놀로지DS-2415+이미징 데이터 저장 및 분석
하드 디스크 드라이브웨스턴 디지털WD80EFZXRED 8TB, 5400RPM급 SATA 6Gb/s 128MB 캐시 3.5인치. 이미징 데이터 저장(10개 드라이브 + 2개 드라이브 이중화)
소프트웨어
형광 획득하마마쓰HC이미지 DIA20fps에서 2채널(GCaMP5 및 mCherry) 형광 이미지 시퀀스 기록
명시야 획득FLIR(구 Point Grey Research)플라이캡처명시야 JPEG 이미지 시퀀스 기록
스테이지 직렬 포트 리더분재https://bitbucket.org/horizongir/bonsai동작 중 웜 추적을 용이하게 합니다.
LED 컨트롤러 소프트웨어자이스마이크로 툴박스 테스트 2011Colibri.2 장치의 다양한 LED에 대한 강도 및 트리거 입력을 설정하려면
이미지J 국립보건원(NIH)https://imagej.net/Fiji/DownloadsRatiometric Quantitation 소프트웨어로 가져오기 위해 이미지 염기서열 및 형식 변경 사항을 간단하게 검토
뛰어나다마이크로소프트 제2002984-001-000001MATLAB 분석을 위해 Volocity에서 쉼표로 구분된 값 데이터의 부분 집합을 생성하는 데 사용됩니다.
Peak 결과MATLAB을R2017aRatio peak feature 계산에 사용되는 스크립트
비율계량(Ratiometric) 정량 분석퍼킨 엘머볼로시티 6.3비율계량 이미지 채널 계산, 객체 찾기를 위한 이미지 세분화 및 발견된 오브젝트의 비율 측정을 용이하게 합니다.
스크립트
AnalyzeGCaMP_2017.mMATLAB을평균 비율 및 XY 중심 스크립트비율계량 출력을 .csv 형식으로 분석하고, 객체와 중심 위치를 통합하고, 비율 변화(ΔR/R)를 계산하고, 피크 및 피크 특징을 식별하고, 포스트스크립트 형식으로 플롯(주석이 달린 피크 포함 및 제외)을 작성합니다. 매트릭스 파일 가져오기의 경우 스크립트는 데이터를 analyzed, peaks 및 traces의 세 가지 폴더로 출력합니다. '분석된' 출력은 시간(s), 면적(제곱 미크론), 비율, X 중심(미크론), Y 중심(미크론) 및 ΔR/R의 6개 열(단위)로 구성된 통합 개체의 매트릭스 파일입니다.'Peaks' 출력은 발견된 피크의 시점, 진폭(ΔR/R 단위), 피크 너비(s), 그리고 봉우리의 탁월함. 'Traces' 출력은 칼슘 미량의 포스트스크립트 파일입니다.
XY-stage-final.분재분재TTL 트리거 DAQ 및 스테이지 위치 시리얼 포트 리더X 및 Y s를 기록합니다.tag연결된 Arduino가 프레임 노출 중에 sCMOS 카메라로부터 포지티브 TTL 신호를 수신할 때 e 위치(미크론 단위). 스크립트는 프레임 번호, X 위치(미크론), Y 위치(미크론) 및 프레임 간 경과 시간(일반적으로 20fps로 녹화할 때 ~50msec)의 4개 열이 있는 .csv 파일을 작성합니다.이 출력의 X 및 Y 스테이지 위치(각각 열 2 및 3)는 AnalyzeGCaM의 X 및 Y 중심 위치에 추가됩니다
년 (영문) (영문) 명 년 의 년 년 호 호 년 포함) ) . 호 기 . . 이상 호 참조하십시오. 참조하십시오.

재인쇄 및 허가

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태그

GCaMP5 mCherry

관련 논문