뇌 절편에서 pedunculopontine 핵 뉴런의 감마 대역 진동 기록

초록

출처: Urbano, F. J., et al. Pedunculopontine 핵 뉴런에서 감마 대역 진동을 기록합니다. J. Vis. 특급. (2016).

이 비디오는 PPN 뉴런에서 감마 대역 진동을 기록하는 방법을 보여줍니다. aCSF의 시냅스 차단제와 함께 시상 뇌 단면을 사용하여 패치 피펫을 통해 양의 전류 펄스를 사용하여 칼슘 채널을 열고 각성을 위한 중요한 하위 임계값 활동을 유도합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 표준-인공 뇌척수액(aCSF)의 준비

1. 원액 A의 준비
   1. 화학 물질을 추가하기 전에 깨끗한 700L 비커에 증류수 1ml를 추가합니다.
   2. 500 ml의 부피를 연속적으로 교반하면서 NaCl 136.75 g, KCl 6.99 g,_MgSO4 2.89 g,_NaH2PO42.83 g을 첨가한다.
   3. 증류수를 더 추가하여 최종 부피 1L에 도달합니다. 희석 후 각 화합물의 최종 농도는 117mM NaCl, 4.69mM KCl, 1.2mM MgSO4 및 1.18mM _NaH2PO4입니다.
   4. 4 °C에서 최대 2주 동안 냉장 보관하십시오.
2. 원액 B의 준비
   1. 화학 물질을 추가하기 전에 깨끗한 700L 비커에 증류수 1ml를 추가합니다.
   2. 500ml의 부피를 계속 교반하면서 D-포도당 41.45g과_NaHCO3 41.84g을 첨가합니다.
   3. 증류수를 더 추가하여 최종 부피 1L에 도달합니다. 희석 후 각 화합물의 최종 농도는 11.5mM D-포도당 및 24.9mM_NaHCO3입니다.
   4. 4 °C에서 최대 2주 동안 냉장 보관하십시오.
   5. 각 실험 전에 스톡 A 50ml와 스톡 B 50ml를 혼합하고 증류수와 함께 1L로 가져와 최종 농도 aCSF 용액을 얻고 최소 30분 동안 탄수화물(95% O₂ - 5% CO₂ 혼합물)로 지속적으로 산소를 공급하면서 RT에 둡니다. 각 실험을 시작할 때만 최종 농도 aCSF를 준비하고 하루가 끝날 때 폐기합니다.

2. 자당-인공 뇌척수액(Sucrose-aCSF)의 제조

1. 원액 C의 제조
   1. 화학 물질을 추가하기 전에 깨끗한 700L 비커에 증류수 1ml를 추가합니다.
   2. 증류수 500ml를 연속적으로 교반하면서 자당 240g,_NaHCO3 6.55g, KCl 0.671g,_MgCl2 4.88g,_CaCl2 0.22g, 아스코르브산 0.21g을 첨가한다.
   3. 증류수를 더 추가하여 최종 부피 1L에 도달합니다. 희석 후, 각 화합물의 최종 농도는 701.1 mM 슈크로스, 78 mM NaHCO3, 9 mM KCl, 24 mM MgCl₂, 1.5 mM CaCl₂ 및 1.2 mM 아스코르브산이다.
   4. 최대 1주일 동안 재고 용액 C를 4°C로 유지하십시오.
   5. 각 실험 전에 스톡 C 50ml 300ml를 증류수 600ml와 혼합하여 최종 농도에서 자당-aCSF 용액을 얻습니다. 최소 30분 동안 탄수화물(95% O₂ - 5% CO₂ 혼합물)로 지속적으로 산소를 공급하면서 RT에서 그대로 둡니다.

3. 슬라이스 준비

1. 깨끗한 비커와 100ml의 수크로오스-aCSF 용액을 얼음에 넣고 탄소로 산소를 공급하고 pH 측정기를 사용하여 pH를 7.4로 고정하면서 0.1M NaOH 용액(pH < 7.4일 때) 또는 0.1M HCl 용액(pH > 7.4일 때)을 몇 방울 떨어뜨립니다.
2. 비브라톰의 절단 챔버를 자당-aCSF로 채우고 산소를 공급합니다. 절단 챔버에 연결된 글리세롤 기반 냉장 시스템을 켜고 0 - 4 °C로 냉각될 때까지 15분 동안 기다립니다.
케타
3. 민(성체 임신 Sprague-Dawley 쥐의 9-12세)을 케타민(70mg/kg, i.p., < 50μl 최종 부피 사용)으로 마취합니다. 강아지가 진정되면 꼬리 꼬집기 반사가 없는지 다시 확인하십시오.
4. 새끼의 목을 베십시오.
   1. 탄소강 메스 날을 사용하여 머리 피부를 앞에서 뒤로 세로로 자르고 집게를 사용하여 피부를 옆으로 당깁니다. 뇌를 덮고 있는 뼈를 자르고 가위를 옆으로 움직여 완전히 제거하여 뇌를 노출시킵니다.
   2. 그런 다음 주걱(처음에는 후각구 아래에 놓고 가장 꼬리 부위를 향해 부드럽게 밀어냅니다)을 사용하여 뇌를 빠르게 제거합니다. 뇌를 얼음으로 냉각된 산소가 공급된 자당-인공 뇌척수액(sucrose-aCSF)으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
5. 우반구에 시상면을 절단하고(반구의 약 1/3을 제거), 뇌의 잘린 면을 진동 슬라이서의 절단 챔버에 자기적으로 고정하여 pedunculopontine nucleus(PPN)를 포함하는 시상 400μm 절편을 절단할 금속 디스크에 붙입니다. 전체 세포 패치 클램프 기록 전에 45분 동안 PPN 슬라이스를 RT로 유지합니다.

4. PPN 슬라이스의 감마 대역 진동 기록

1. Potassium-gluconate Intracellular Solution (High-K+ Solution)의 제조
   1. 깨끗한 비커와 증류수 10ml를 얼음에 넣습니다. 계속 저으면서 K+-글루코네이트, 포스포크레아틴 디트리스염 90.68mg, HEPES 47.66mg, EGTA 1.5mg, Mg²⁺-ATP 40.58mg, Na⁺_2-GTP 4mg을 첨가합니다.
   2. KOH(증류수 중 100mM)로 pH를 7.3으로 조정합니다. 증류수를 추가하여 최종 부피 20mL에 도달합니다. 필요한 경우 자당(증류수 중 100mM)으로 삼투압을 280 - 290mOsm으로 조정합니다. 희석 후 각 화합물의 최종 농도는 124mM K+-글루코네이트, 10mM 포스포크레아틴 디 트리스 염, 10mM HEPES, 0.2mM EGTA, 4mM Mg²⁺-ATP 및 0.3mM Na⁺_2-GTP입니다.
   3. 세포 내 용액을 1 ml 튜브에 나누어 넣고 -20 °C에서 동결합니다. 하루에 한 개의 부분 표본을 사용하고 실험 중에는 4 °C를 유지하십시오.
2. Whole-cell Patch Clamp 기록
   1. 슬라이스를 침지 챔버에 놓고 다음 수용체 길항제: 선택적 NMDA 수용체 길항제 2-아미노-5-포스포노발레르산(APV, 40μM), 경쟁적 AMPA/카이네이트 글루타메이트 수용체 길항제 6-시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온(CNQX, 10μM), 글리신 수용체 길항제 스트리크닌(STR, 10 μM), 특이적 GABA_A 수용체 길항제 가바진(GBZ, 10 μM) 및 나트륨 채널 차단제 테트로도톡신(TTX, 3μM)
      용액 필터가 있는 상용 패치 피펫 필러를 사용하여 기록 패치 피펫(저항 2-7 MΩ, 시중에서 판매되는 1.0 mm 외경 및 0.6 mm의 일반 두꺼운 벽 붕규산 유리 모세관으로 제작)을 세포 내 high-K+ 용액으로 채웁니다. 피펫을 앰프의 홀더에 삽입하십시오. 3방향 밸브에 연결된 실리콘 튜브를 사용하여 피펫 홀더에 연결된 1ml 주사기를 사용하여 작은 양압을 가합니다. 피펫 홀더 뒷면을 패치 cl에 연결합니다.amp amp리퍼.
   2. 근적외선 미분 간섭 대비 광학 장치와 결합된 4X 대물렌즈를 사용하여 기계식 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 PPN 핵 근처로 기록 피펫을 이동합니다.
      메모: PPN 핵은 상소뇌 꽃자루(SCP, 두꺼운 축삭돌기 다발로 관찰 가능)의 등쪽 조각에서 관찰할 수 있습니다. 기록 피펫은 꽃자루의 뒤쪽 끝에서 바로 등쪽에 위치한 PPN pars compacta에 위치했습니다.
   3. 40X 수침 렌즈를 사용하여 시각화하는 동안 기록 피펫을 PPN 뉴런과 접촉시키고 빠르게 음의 흡입을 적용하여 세포와 밀봉을 형성합니다.
   4. 전압 클램프 밀봉 소프트웨어를 사용하여 제조업체의 프로토콜을 사용하여 음흡입 중 피펫 저항을 모니터링하십시오.
      1. 음의 흡입이 서서히 증가하고 피펫 팁의 패치 클램프 모니터에서 판독한 저항 값이 80 - 100 MOhm에 도달하면 유지 전위를 -50 mV로 빠르게 변경하고 음압을 해제합니다. 뉴런의 막이 파열되고 전체 세포 구성에서 전기적 접근이 이루어질 때까지 지속적으로 음의 흡입을 가하기 시작합니다.
      2. 전압 클램프 씰 소프트웨어로 측정한 액세스 저항 값이 10 MOhm 이상인 경우 더 적은 양으로 음의 흡입을 계속하십시오.
   5. 전압 클램프 모드에서 커패시턴스(즉, 셀의 멤브레인을 파열시킨 후 관찰되는 느리고 빠른 과도 현상) 및 직렬 저항을 보상합니다. 녹음 모드를 현재 cl로 전환amp, 브리지 값을 빠르게 보상합니다(예: ampliifier 노브 또는 컴퓨터 마우스를 사용하여 자동 보정 메뉴 클릭).
      1. 제조업체의 프로토콜을 사용하여 기록되는 PPN 뉴런의 휴지막 전위를 지속적으로 모니터링합니다. 휴지 멤브레인 전위가 탈분극 또는 과분극 값으로 이동하는 경우 소량의 직류(최대 100pA)를 사용하여 최적의 -50mV 최종 값을 유지합니다.
         메모: 안정적인 휴지막 전위(RMP)가 -48mV 이상(즉, RMP < -48mV)인 PPN 뉴런만 유지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자당	시그마-알드리치	S8501 (영어	C12H22O11, 분자량 = 342.30
중탄산나트륨	시그마-알드리치	S6014	NaHCO3, 분자량 = 84.01
염화칼륨	시그마-알드리치	P3911	KCl, 분자량 = 74.55
염화마그네슘 Hexahydrate	시그마-알드리치	M9272	MgCl2 ·6H2O, 분자량 = 203.30
Calcium Chloride Dihydrate (염화칼슘 이수화물)	시그마-알드리치	C3881	CaCl2 ·2H2O, 분자량 = 147.02
D-(+)-포도당	시그마-알드리치	G5767	C6H12O6, 분자량 = 180.16
L-아스코르브산	시그마-알드리치	A5960	C6H8O6, 분자량 = 176.12
소금	아크로스 오가닉스	327300025	NaCl, 분자량 = 58.44
글루콘산 칼륨	시그마-알드리치	G4500	C6H11KO7, 분자량 = 234.25
포스포크레아틴 디(트리스) 염	시그마-알드리치	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, 분자량 = 453.38
헤페스	시그마-알드리치	H3375 (영문	C8H18N2O4S, 분자량 = 238.30
에그타	시그마-알드리치	0396회	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, 분자량 = 380.40
아데노신 5'-트리포스페이트 마그네슘 염	시그마-알드리치	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, 분자량 = 507.18
구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염 수화물	시그마-알드리치	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, 분자량 = 523.18
테트로도톡신 시트레이트	알로몬 연구소	T-550	C11H17N3O8, 분자량 = 319.27
DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric 산	시그마-알드리치	A5282	C5H12NO5P, 분자량 = 197.13
CNQX 디소듐 염 수화물	시그마-알드리치	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, 분자량 = 276.12
스트리크닌	시그마-알드리치	S0532	C21H22N2O2, 분자량 = 334.41
메카밀라민 염산염	시그마-알드리치	M9020	C11H21N · HCl, 분자량 = 203.75
가바진(SR-95531)	시그마-알드리치	시즌 106	C15H18BrN3O3, 분자량 = 368.23
케타민 염산염	마일란	67457-001-00
현미경	니콘	이클립스 E600FN
마이크로 매니퓰레이터	셔터 기기	어란-200
마이크로 매니퓰레이터	셔터 기기	MPC-200
증폭기	분자 장치	멀티클램프 700B
A/D 컨버터	분자 장치	디지데이터 1440A
히터	워너 인스트루먼트	TC-324B
펌프	콜-파머	마스터플렉스 L/S 7519-20
펌프 카트리지	콜-파머	마스터플렉스 7519-85
피펫 풀러	셔터 기기	P-97
사진기	Q-이미징	RET-200R-F-M-12-C
비브라톰	라이카 바이오시스템즈	라이카 VT1200 S
냉동 시스템	비브라톰 악기	900R
설비
현미경	니콘	이클립스 E600FN
마이크로 매니퓰레이터	셔터 기기	어란-200
마이크로 매니퓰레이터	셔터 기기	MPC-200
증폭기	분자 장치	멀티클램프 700B
A/D 컨버터	분자 장치	디지데이터 1440A
히터	워너 인스트루먼트	TC-324B
펌프	콜-파머	마스터플렉스 L/S 7519-20
펌프 카트리지	콜-파머	마스터플렉스 7519-85
피펫 풀러	셔터 기기	P-97
사진기	Q-이미징	RET-200R-F-M-12-C

) 시리즈 (영문) 시리즈 ) (영문) 시리즈 시리즈