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방법 논문

피하 Muscarinic Antagonists의 관리 및 마우스에 Levator Auris의 Longus 근육의 트리플 - Immunostaining

13.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/3124

⸱

2011년 9월 8일

 ,  , 
1Biology Department, Arcadia University, 2Shriners Hospitals Pediatric Research Center, Temple University School of Medicine, 3Shriners Hospitals Pediatric Research Center and Department of Anatomy and Cell Biology, Temple University School of Medicine

이 논문에서

요약

우리는 levator auris의 longus (랄) 젊은 성인 마우스의 근육을 muscarinic 신호의 억제제의 반복 관리와 wholemounts 년에 신경근육학 분기점의 후속 immunostaining (NMJs)에 대한 절차를 설명합니다. 랄 근육이 공개에 대해 고유한 장점이 있습니다 생체내에 약리 효과.

초록

이러한 gastrocnemius 및 정강뼈 앞쪽에 같은 설치류 동물, 뒷다리의 사지 근육은 자주 포유 동물 NMJs의 형성 및 유지에 필수적인 신호의 생체내 약리 연구에 사용됩니다. 그러나, 피하 또는 근육 관리 후이 근육에 약물 침투가 종종 불완전하거나 고르지이며 많은 NMJs는 영향을받지 남아있을 수 있습니다. 이러한 미니 펌프와 같은 장치와 함께 체계적인 관리가 spatiotemporal 효과를 향상시킬 수 있지만,이 방법의 침략 자연 혼란함을 주죠 염증 반응 및 / 또는 직접 근육 손상을 일으킬 수 있습니다. 그것이 시간이 많이 걸리는 시리얼 sectioning 및 광범위한 immunostaining을 필요로하기 때문에 또한 뒷다리 근육에 NMJs 완벽하게 분석 도전이다.

마우스 랄은 목 dorsum에 피상적으로있는 근육의 얇은 평면 시트입니다. 이 기능은 날개를 이동하는 빠른 트위치 근육이다. 이것은 두개골의 정중선에서 발생한 각 날개의 연골 부분에 옆으로 확장 주동이의와 꼬리 부분을 포함하고 있습니다. 근육은 그것이 종료 stylomastoid 구멍을 같은 caudally 프로젝트 안면 신경의 한 분과로 제공됩니다. 우리와 다른 NMJs 및 근육에 약물의 생체내 효과의 단기 및 장기 모두의 조사에 대한 이점을 제공하는 편리 준비하는 랄 발견했다. 첫째, 그 표면 위치는 가벼운 마취 약품의 여러 지역의 애플 리케이션을 용이하게합니다. 둘째, 그 두께 (근육 섬유로부터 2-3 층)은 근육 내의 거의 모든 NMJs의 시각화 및 분석을 수 있습니다. 셋째, 그 innervation의 패턴과 함께 자사의 신경 손상으로 해부의 용이성은 체외 9,5에 보충 electrophysiological 분석이 이루어질 수 있습니다. 아마도 마지막으로, 그리고 가장 중요한, 작은 볼륨 적용 (~ 50μl)는 쉽게 전체 근육의 표면을 커버 약물에 모든 NMJs의 유니폼 및 장기 노출을 제공하고 체계적인 접근 1,8의 필요성을 없애줍니다.

프로토콜

1. muscarinic 아세틸콜린 수용체 (mAChR) antagonists의 피하 관리

  1. 1.5mL 반응 관에 멸균 생리 식염수에 마약을 분해하여 무균 조건 mAChR 길항제의 적절한 복용량 (참조하라, 테이블)에서 준비합니다. 다음 antagonists 사용되었습니다 아트로 핀, Methoctramine, 4 축축한, AFDX - 116, AFDX - 384, MT 7.
  2. a1cc 인슐린 주사기로 솔루션의 50μl를 그려 각 마우스에 대해 별도의 주사기를 사용합니다. 또한 전용 컨트롤 그룹에있는 각 마우스에 대한 생리 식염수가 들어있는 주사기가 준비합니다. 주입 준비까지 얼음에 주사기 보관하십시오.
  3. 핀치를 발끝에 응답의 부족을 관찰하여 적절한 마취 심도를 확인 케타민을 - xylazine 칵테일 (120 MG / kg 마취제, 8 MG / kg xylazine)와 생쥐를 마취.
  4. 적절한 진정제를 맞았 후, 목 꼬리 영역에 머리의 주동이의 영역을 다루는 면도를 70 % 에탄올로 떨어져 머리를 나머지 닦으십시오.
  5. 플레이스 stereomicroscope 아래의 마우스, 그리고 주사기 (그림 1A, B)의 바늘에 가볍게 위로 당기면서 랄 근육에 주사 바늘 평행를 삽입합니다. 이것은 바늘이 결합 조직을 overlying에 삽입하고 직접 랄 근육 자체를 손상하지 않는 것을 보장합니다. 팁이 랄 근육의 꼬리 부분을 커버 있도록 바늘을 삽입합니다.
  6. 아주 천천히 주사기를 철수하면서 오른쪽 랄 근육 이상의 솔루션을 주입하기 시작하며, 총 주입 시간은 약 일분해야합니다. 제대로 주입하면, 솔루션은 하나 이상의 시간 동안 유지됩니다 overlying 피부에 직경 약 1cm입니다 "돔"을 형성한다. 균일하게 주입 솔루션은 바로 랄 근육의 전체 주동이의 꼬리와 지역을 커버합니다.
  7. 1~7일에 대한 12 시간마다 절차를 반복합니다. 기타 studies1 들어, 우리는 최대 21일하는 성장 요인에게 매 12 시간을 삽입하기 위해 동일한 프로토콜을 사용합니다. 더 이상 응답은 최대 21일하는 마취의 2X 하루 투여 마우스에서 관찰되지 않았습니다.

2. 랄 근육의 해부

  1. pentobarbital 나트륨의 과다 (390 MG / kg)와 쥐를 안락사. 죽음은 thoracotomy를 수행한 후에는 심장 박동의 부족을 평가하여 보증합니다.
  2. 각 포 1 핀과 코로 1 핀, 해부 접시에 등의 측면을 마우스를 아래로 핀.
  3. 왼쪽 견갑골 주변 지역에 귀를 단 근위 지역에서 왼쪽 랄을 따라 잘라 작은 봄 가위를 사용하여, 오직 피부를 통해 첫 절개를합니다.
  4. 조심스럽게이 지역에있는 피부를 제거하지만, 이것이 바로 랄 근육에 대한 첨부 파일의 포인트 중 하나이기 때문입니다 오른쪽 귀에 너무 가까이 절단하지 마십시오.
  5. 좌우 랄 근육이 만나는 머리 표면 표면에 정중선을 따라 지질의 중앙 위치에 지방 조직의 스트립을, 찾습니다. 작은 스프링 가위를 사용하여 어깨 (그림 1C)를 도달하기 전까지 왼쪽 랄 근육의 근위 가장자리에서 지방 조직 (왼쪽 귀 방향)의 오른쪽에 1cm 했네요.
  6. 일단 절개는 근육의 복부 측면을 폭로 작은 집게로 다시 오른쪽 랄 근육 껍질, 이루어집니다. 포셉 (그림 1C)와 오른쪽 랄 근육을 신중하게 뽑고하면서 결합 조직과 근막을 낸다.
  7. (内耳)의 기지에서 오른쪽 랄의 꼬리 끝에 주위 컷. , 절삭 오른쪽 귀의 주동이의 끝을 향해 움직이고, 오른쪽 랄은 (그림 1C) 인계 유지를 계속합니다.. 그것은 자체 랄을 망가뜨릴 이상이 단계에서 더 많은 조직을 포함하는 것이 좋습니다. 근육은 근육을 통해 피펫 1X PBS를 건조하기 시작하면.
  8. 장소가 1X PBS, 등의 측면을 포함 30mm 문화 Sylgard 요리의 오른쪽 랄 해부 했어요. 작은 곤충 핀과 근육의 네 귀퉁이를 핀.
  9. 오른쪽 랄 근육의 지느러미와 복부 표면에서 작은 집게와 봄 가위, 깨끗한 결합 조직을 사용합니다. 복부 표면을 청소하기 위해 근육을 뒤집어 다시 핀. 2-3 근육 같은 30mm 접시에 게재될 수 있습니다.

3. 랄 NMJs의 트리플 immunostaining : 1 일

  1. 를 시작 immunostaining 전에 모든 필요한 시약을 준비합니다. 1X PBS, 2% 소 혈청 알부민 BSA) / PBS, 2 %에 0.1M 글리신 BSA / PBS, 2퍼센트 BSA / PBS 및 1X PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA)의 0.2 % 트리톤의 X100이 필요합니다. -20 ° C의 냉장고에 미리 냉각 메탄올.
  2. 이 과정에서 접시 등의 측면에 고정된 랄 근육을 둡니다. 1X PBS 솔루션을 무시하고 근육을 감추기에 충분 할만큼 4퍼센트 (PFA)를 추가합니다. 쉐이크에 플레이스 요리 20 분 동안 속도를 2 또는 3으로 설정합니다. 별도의 언급이없는 한, 접시는 다음 단계를 흔드는에 배치해야합니다.
  3. 4퍼센트 PFA를 버리고 1X PBS 3 회, 10 '각 근육을 씻으십시오.
  4. 마지막 1X PBS 30 '을위한 2 %의 BSA / PBS 용액을 0.1M 글리신을 씻고 추가 삭제.
  5. 0.1M 글리신 솔루션을 삭제하시겠습니까에게D 추가 1X PBS 15 '에 대한 1:200의 농도에 rhodamine 복합 α - bungarotoxin를 포함.
  6. α - bungarotoxin 솔루션을 버리고 1X PBS, 3 번 10 '각각의 근육을 씻으십시오.
  7. 사전 냉각 메탄올을 추가하여 조직을 Permeabilize하고 정확하게 5 분 -20 ° C의 냉장고에 음식을 배치, 아무 필요 떨고 없습니다.
  8. 메탄올을 제거하고 3 회 10 '1X PBS로 각각 씻으십시오. 지난 세척하고 차단 조직을 폐기 0.2 % 트리톤 X - 100 2퍼센트에 BSA / PBS 1 시간. 세탁과 차단 단계는 실온에서 수행됩니다.
  9. 4, 흔들림, 밤새 근육을 품어 ° 차단 솔루션 (참조하라, 표)에 희석 기본 항체의 칵테일 C.

4. 랄 NMJs의 트리플 immunostaining : 날 2

  1. 1X PBS 3 회, 10 '상온에서 각 근육을 씻으십시오.
  2. 실온에서 1 시간 (참조하라, 테이블)에 대한 솔루션을 차단에서 이차 항체의 칵테일을 추가합니다. 알렉사 - 플루어 647 형광의 사진 표백을 방지하기 위해 근육이 단계 이후의 빛으로부터 보호되어야합니다.
  3. 1X PBS에 3 번, 10 '각 근육을 씻으십시오.
  4. 1X PBS에 남아있는 결합 조직을 청소, 랄 근육의 측면 가장자리를 잘라 슬라이드에있는 특정 측면을 탑재, 유리 커버 - 풀렸는데 장착 미디어를 사용합니다. 장소에 커버 슬립을 확보하기 위해 명확한 매니큐어를 사용하십시오.
  5. 분석을위한 준비까지 -20 ° C에서 빛과 가게에서 슬라이드를 보호할 수 있습니다.

5. 랄 NMJs의 공촛점 이미징

  1. 고해상도 공촛점 이미지는 Leica TCS 4D 공촛점 현미경에 Leica 계획 APO 63X 오일 목적 (1.4NA)를 얻을 수 있습니다.
  2. 플루오레신와 알렉사 647 신호를 동시에 각각의 레이저 라인 488 NM (아르곤, 488 NM, 20 MW)와 633 nm의 (HeNe, 633 NM, 10 MW)로 스캔했다. 순차적으로, Rhodamine 신호는 다음 레이저 라인 561 NM (DPSS, 561, 20 MW)를 스캔합니다. 광학 섹션은 0.3 μm의 간격으로 수집하고, Z - 비행기에서 이미지의 숫자는 60-80에서 변화했다. 핀홀은 에어리 1 (107.97 음)으로 조정됩니다. 이미지 포맷 1,024 X 1,024 (X, Y), 234.32 μm의 X 234.32 μm의 및 229.05 NM의 픽셀 크기를 X 229.05 NM의 이미지 크기 400Hz 속도 결과 1의 줌 계수와.
  3. Leica TCS - NT 수집 소프트웨어는 다음 최대 강도 예측에 Z - 시리즈 이미지를 재구성하는 데 사용됩니다.
  4. Multipanel 이미지는 어도비 포토샵을 사용하여 밝기 및 대비를 위해 조정됩니다.
  5. 전형적인 랄 근육 들어, 하나는 약 75-100 EN의 얼굴 NMJs를 분석할 수 있어야합니다. 시냅스 안정성 등 사전, 페리 및 postsynaptic 요소들의 공간적 배열 (즉, 신경, Schwann 세포와 근육)과 같은 기능 및 신경 영역의 측정 (예 : 버렸네 크기)에 의해 결정됩니다.

대표 결과 :

정확하게 nicotinic AChRs의 postsynaptic 클러스터 (; 레드 그림 2) apposed 하나의 근육 섬유에, 어른 포유류 NMJ에서 하나의 모터 축삭은 신경 단말기의 매우 차별 아보스 (그린 그림 2) 양식 멋진 가지를 elaborates . Perisynaptically 터미널 Schwann 세포가 밀접하게 presynaptic 신경 터미널의 모든 지점 (; 블루 그림 2) 커버. 이 삼자 간의 조직의 구조와 기능 무결성이 심각하게 subtype 특정 mAChR 억제제의 일상 응용 프로그램에 의해 불안정하게된다 는걸 알수 있습니다. 여기에 제시된 예제 (그림 3)에서 4 축축한, M1, M3, M4와 M5 mAChR의 subtypes에 대한 높은 친화력을 가진 mAChR 길항제는 (그림 3B, 근육의 표면에 걸쳐 많은 NMJs에서 신경 단말기의 선택 제거를 끝 C). 처리 확장하지 않고 밝은 S100 라벨 (그림 3B "3C")에 의해 입증로서뿐만 아니라, 터미널 Schwann 세포는 8 비정상적으로 정지됩니다. Postsynaptically, 근육 섬유는 정상이며 nAChRs에 대한 손실 (그림 3B ', 3C'는) 없습니다.

그림 1
그림 1. 랄 근육의 해부 학적 위치 및 조직입니다. 주동이의 (rLAL), 꼬리 (cLAL) 및 랄 신경 (LALn) 및 해당 endplate 밴드의 위치 (A, 삽입된 페이지) 표시됩니다. 랄 근육에 대하여에있는 바늘의 위치와 방향은 사출 절차 (B)에 표시됩니다. 절개 포인트는 절개 절차 (C)에 대해 표시됩니다.

그림 2
그림 2. NMJ의 삼자 간의 조직입니다. 마우스 NMJ의 높은 배율 공촛점 전망. 하나의 축삭은 단단히 터미널 Schwann 세포와 그 프로세스 (터미널 Schwann 세포 기관을 '별표 점)이 적용되는 고급 터미널 지점 (A), elaborates. Postsynaptically 근육 섬유에 nicotinic AChRs의 클러스터가 정확하게 신경 termi의 지점에 apposed입니다nals 및 단말 Schwann 세포.

그림 3
그림 3. 랄 근육이 4 습기, mAChR 길항제로 치료. 랄 근육의 낮은 높은 배율 공촛점 전망 차량 또는 4 - 습기 취급. 차량 취급 근육 (4 습기 - 대우 근육 부족 신경 터미널 (의 A - '''), 수많은 NMJs 대조적으로 B - B ''C - C '''). 그림 2B의 박스 영역을 그림 2C에 확대한 것입니다.

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토론

여기서 제시하는 방법은 포유 동물 NMJs의 안정성과 유지 보수에 신호 subtype 특정 mAChR의 이전에 인식되지 않는 역할의 조사를 허용합니다. 이 방법은 또한 neurotrophic 요인과 약리 대리인의 효과를 테스트하기 위해 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 저희 연구실은 Ciliary Neurotrophic 팩터 (CNTF)는 성인 생쥐의 거의 모든 랄 신경 터미널에서 돋아 elicited 것으로 나타났습니다 1 . 이 결과는 CA에서 돋아 중간보고 CNTF - 대우 뒷다리 사지 근육의 사전 연구와 대조. gluteus 및 측면 gastrocnemius 분기점 3의 9 %에서 13~33%. 우리는 차이가 뒷다리 근육보다 랄에 CNTF에 신경 터미널보다 균일한 및 장기 노출에 의한 있다고 생각했습니다. 실제로, 우리가 수평 gastrocnemius 및 광범위한 거의 모든 랄 NMJs에서 돋아을 elicited 동일한 프로토콜을 사용 정강뼈 앞쪽에 근육에 CNTF 적용하면, 우리는 약한...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 근육질 영양 장애 협회, NIH (NS062320)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
마취제 Hospira NDC0409 - 2051-05 복용량 : 120mg/kg
xylazine 로이드 레버 토리스 LA33806 복용량 : 8mg/kg
아트로 핀 시그마 - 알드리치 A0132 (> 98 % 순도); 복용 : 0.2mg/kg - 20mg/kg
아트로 핀 보이트 글로벌 유통 AT105 제약 학년
Methoctramine 시그마 - 알드리치 M105 복용량 : 100 - 400M
4 - 습기 시그마 - 알드리치 D142 복용량 : 2.5mg/kg
AFDX - 116 Bioscience Tocris 1105 250M
AFDX - 384 Bioscience Tocris 1345 50M - 500 미터
MT 7 펩티드 국제 PMT - 4340 - S 0.1M - 1M
1X 인산은 살린, 산도 7.4 버퍼 Invitrogen 10010049
Paraformaldehyde 어부 T353 - 500 10g/100mL 드 이온화 증류수를 용해하여 처음 10 %의 솔루션을 만들어, 1X PBS로 4 % 수 있도록, 7.4으로 산도를 조절
pentobarbitol 나트륨 Virbac 동물 보건 NDC - 051311 - 050-01 복용량 : 390mg/kg
Sylgard 다우 코닝 부품 # 184 필요에 따라 (30mm, 60mm, 100mm) 크기의 여러 문화 요리를 사용할 수 키트와 함께 지시 사항을 따르십시오
0.1M 글리신 시그마 - 알드리치 G - 7126 추가 2% BSA / PBS의 0.185g을 25mL
2퍼센트 소 혈청 알부민 (2 % BSA) 시그마 - 알드리치 A3059 - 100g 1X PBS의 100mL에 2g BSA를 디졸브
2퍼센트에서 0.2 % 트리톤 X100 BSA / PBS (차단 버퍼) 시그마 - 알드리치 T9284 - 100mL 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS를 디졸브
α - bungarotoxin Invitrogen T1175 1:200의 농도에서 사용
SMI - 312 Sternberger의 Monoclonals SMI312 1:1000의 농도에서 사용
SV2 발달 연구 브리 도마 뱅크 SV2 - 뜨는 1시 10분의 농도에서 사용
S100 Dako Z0311 1:400의 농도에서 사용
FITC - 염소 방지 마우스 IgG1 로체 03117731001 1:200의 농도에서 사용하지만, 배경이 높으면, 1:400을 시도
알렉사 - 플루어 647 복합 염소 안티 - 토끼 Invitrogen A21244 1:200의 농도에서 사용
Vectashield 형광 설치 미디어 벡터 실험실 H - 1000 이것은 하드 세트 미디어 아니라, 당신이 투명 매니큐어로 커버 슬립을 확보해야합니다.
소형 스프링 가위 파인 과학 도구 15002-08
해부의 포셉 파인 과학 도구 11295-51

참고문헌

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  5. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
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  7. Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
  8. Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
  9. Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
  10. Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
  11. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
  12. Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
  13. Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).

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