우리는 levator auris의 longus (랄) 젊은 성인 마우스의 근육을 muscarinic 신호의 억제제의 반복 관리와 wholemounts 년에 신경근육학 분기점의 후속 immunostaining (NMJs)에 대한 절차를 설명합니다. 랄 근육이 공개에 대해 고유한 장점이 있습니다 생체내에 약리 효과.
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방법 논문
피하 Muscarinic Antagonists의 관리 및 마우스에 Levator Auris의 Longus 근육의 트리플 - Immunostaining
이 논문에서
요약
초록
이러한 gastrocnemius 및 정강뼈 앞쪽에 같은 설치류 동물, 뒷다리의 사지 근육은 자주 포유 동물 NMJs의 형성 및 유지에 필수적인 신호의 생체내 약리 연구에 사용됩니다. 그러나, 피하 또는 근육 관리 후이 근육에 약물 침투가 종종 불완전하거나 고르지이며 많은 NMJs는 영향을받지 남아있을 수 있습니다. 이러한 미니 펌프와 같은 장치와 함께 체계적인 관리가 spatiotemporal 효과를 향상시킬 수 있지만,이 방법의 침략 자연 혼란함을 주죠 염증 반응 및 / 또는 직접 근육 손상을 일으킬 수 있습니다. 그것이 시간이 많이 걸리는 시리얼 sectioning 및 광범위한 immunostaining을 필요로하기 때문에 또한 뒷다리 근육에 NMJs 완벽하게 분석 도전이다.
마우스 랄은 목 dorsum에 피상적으로있는 근육의 얇은 평면 시트입니다. 이 기능은 날개를 이동하는 빠른 트위치 근육이다. 이것은 두개골의 정중선에서 발생한 각 날개의 연골 부분에 옆으로 확장 주동이의와 꼬리 부분을 포함하고 있습니다. 근육은 그것이 종료 stylomastoid 구멍을 같은 caudally 프로젝트 안면 신경의 한 분과로 제공됩니다. 우리와 다른 NMJs 및 근육에 약물의 생체내 효과의 단기 및 장기 모두의 조사에 대한 이점을 제공하는 편리 준비하는 랄 발견했다. 첫째, 그 표면 위치는 가벼운 마취 약품의 여러 지역의 애플 리케이션을 용이하게합니다. 둘째, 그 두께 (근육 섬유로부터 2-3 층)은 근육 내의 거의 모든 NMJs의 시각화 및 분석을 수 있습니다. 셋째, 그 innervation의 패턴과 함께 자사의 신경 손상으로 해부의 용이성은 체외 9,5에 보충 electrophysiological 분석이 이루어질 수 있습니다. 아마도 마지막으로, 그리고 가장 중요한, 작은 볼륨 적용 (~ 50μl)는 쉽게 전체 근육의 표면을 커버 약물에 모든 NMJs의 유니폼 및 장기 노출을 제공하고 체계적인 접근 1,8의 필요성을 없애줍니다.
프로토콜
1. muscarinic 아세틸콜린 수용체 (mAChR) antagonists의 피하 관리
- 1.5mL 반응 관에 멸균 생리 식염수에 마약을 분해하여 무균 조건 mAChR 길항제의 적절한 복용량 (참조하라, 테이블)에서 준비합니다. 다음 antagonists 사용되었습니다 아트로 핀, Methoctramine, 4 축축한, AFDX - 116, AFDX - 384, MT 7.
- a1cc 인슐린 주사기로 솔루션의 50μl를 그려 각 마우스에 대해 별도의 주사기를 사용합니다. 또한 전용 컨트롤 그룹에있는 각 마우스에 대한 생리 식염수가 들어있는 주사기가 준비합니다. 주입 준비까지 얼음에 주사기 보관하십시오.
- 핀치를 발끝에 응답의 부족을 관찰하여 적절한 마취 심도를 확인 케타민을 - xylazine 칵테일 (120 MG / kg 마취제, 8 MG / kg xylazine)와 생쥐를 마취.
- 적절한 진정제를 맞았 후, 목 꼬리 영역에 머리의 주동이의 영역을 다루는 면도를 70 % 에탄올로 떨어져 머리를 나머지 닦으십시오.
- 플레이스 stereomicroscope 아래의 마우스, 그리고 주사기 (그림 1A, B)의 바늘에 가볍게 위로 당기면서 랄 근육에 주사 바늘 평행를 삽입합니다. 이....
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토론
여기서 제시하는 방법은 포유 동물 NMJs의 안정성과 유지 보수에 신호 subtype 특정 mAChR의 이전에 인식되지 않는 역할의 조사를 허용합니다. 이 방법은 또한 neurotrophic 요인과 약리 대리인의 효과를 테스트하기 위해 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 저희 연구실은 Ciliary Neurotrophic 팩터 (CNTF)는 성인 생쥐의 거의 모든 랄 신경 터미널에서 돋아 elicited 것으로 나타났습니다 1 . 이 결과는 CA에서 돋아 중간보고 CNTF - 대우 뒷다리 사지 근육의 사전 연구와 대조. gluteus 및 측면 gastrocnemius 분기점 3의 9 %에서 13~33%. 우리는 차이가 뒷다리 근육보다 랄에 CNTF에 신경 터미널보다 균일한 및 장기 노출에 의한 있다고 생각했습니다. 실제로, 우리가 수평 gastrocnemius 및 광범위한 거의 모든 랄 NMJs에서 돋아을 elicited 동일한 프로토콜을 사용 정강뼈 앞쪽에 근육에 CNTF 적용하면, 우리는 약한.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 근육질 영양 장애 협회, NIH (NS062320)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 마취제 | Hospira | NDC0409 - 2051-05 | 복용량 : 120mg/kg |
| xylazine | 로이드 레버 토리스 | LA33806 | 복용량 : 8mg/kg |
| 아트로 핀 | 시그마 - 알드리치 | A0132 | (> 98 % 순도); 복용 : 0.2mg/kg - 20mg/kg |
| 아트로 핀 | 보이트 글로벌 유통 | AT105 | 제약 학년 |
| Methoctramine | 시그마 - 알드리치 | M105 | 복용량 : 100 - 400M |
| 4 - 습기 | 시그마 - 알드리치 | D142 | 복용량 : 2.5mg/kg |
| AFDX - 116 | Bioscience Tocris | 1105 | 250M |
| AFDX - 384 | Bioscience Tocris | 1345 | 50M - 500 미터 |
| MT 7 | 펩티드 국제 | PMT - 4340 - S | 0.1M - 1M |
| 1X 인산은 살린, 산도 7.4 버퍼 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | 어부 | T353 - 500 | 10g/100mL 드 이온화 증류수를 용해하여 처음 10 %의 솔루션을 만들어, 1X PBS로 4 % 수 있도록, 7.4으로 산도를 조절 |
| pentobarbitol 나트륨 | Virbac 동물 보건 | NDC - 051311 - 050-01 | 복용량 : 390mg/kg |
| Sylgard | 다우 코닝 | 부품 # 184 | 필요에 따라 (30mm, 60mm, 100mm) 크기의 여러 문화 요리를 사용할 수 키트와 함께 지시 사항을 따르십시오 |
| 0.1M 글리신 | 시그마 - 알드리치 | G - 7126 | 추가 2% BSA / PBS의 0.185g을 25mL |
| 2퍼센트 소 혈청 알부민 (2 % BSA) | 시그마 - 알드리치 | A3059 - 100g | 1X PBS의 100mL에 2g BSA를 디졸브 |
| 2퍼센트에서 0.2 % 트리톤 X100 BSA / PBS (차단 버퍼) | 시그마 - 알드리치 | T9284 - 100mL | 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS를 디졸브 |
| α - bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | 1:200의 농도에서 사용 |
| SMI - 312 | Sternberger의 Monoclonals | SMI312 | 1:1000의 농도에서 사용 |
| SV2 | 발달 연구 브리 도마 뱅크 | SV2 - 뜨는 | 1시 10분의 농도에서 사용 |
| S100 | Dako | Z0311 | 1:400의 농도에서 사용 |
| FITC - 염소 방지 마우스 IgG1 | 로체 | 03117731001 | 1:200의 농도에서 사용하지만, 배경이 높으면, 1:400을 시도 |
| 알렉사 - 플루어 647 복합 염소 안티 - 토끼 | Invitrogen | A21244 | 1:200의 농도에서 사용 |
| Vectashield 형광 설치 미디어 | 벡터 실험실 | H - 1000 | 이것은 하드 세트 미디어 아니라, 당신이 투명 매니큐어로 커버 슬립을 확보해야합니다. |
| 소형 스프링 가위 | 파인 과학 도구 | 15002-08 | |
| 해부의 포셉 | 파인 과학 도구 | 11295-51 |
참고문헌
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y.
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재인쇄 및 허가
