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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 두 개의 양극성 전극이 있는 헤드셋 만들기(그림 1)
- 3.5cm의 스테인리스 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅된 스테인리스강 와이어를 자릅니다.
- 양쪽 끝의 전선에서 절연 코팅을 약 1mm 벗겨냅니다. 와이어가 너무 많이 벗겨지지 않도록 하십시오.
- 더 긴 슬릿이 있는 핀의 하단 부분이 아래를 향하도록 바이스 홀더에 두 개의 핀을 놓습니다.
- 와이어의 벗겨진 끝과 핀 상단에 플럭스를 적용합니다.
- 와이어의 벗겨진 부분을 코팅하기에 충분한 땜납으로 주석을 칠하십시오.
- 측면에 넘치지 않도록 핀 상단에 최소한의 땜납을 추가하십시오.
- 땜납이 녹는 동안 전선의 벗겨진 끝의 한쪽 끝을 가능한 한 깊이 핀에 넣습니다.
메모: 와이어가 나올 수 있는 측면 구멍이 있습니다 - 와이어가 핀에서 나오지 않도록 하십시오. 벗겨진 모든 와이어는 핀 내에 있어야 합니다.
- 두 번째 핀에 대해 1.6-1.7 단계를 반복하고 이제 와이어의 다른 벗겨진 끝을 사용합니다.
- 핀을 30초 동안 그대로 두어 고정하고 바이스 홀더에서 핀을 제거한 다음 핀을 당겨 와이어와 핀 사이의 연결이 강하고 고정되는지 확인합니다.
- 핀을 찬물로 헹구고 말리십시오.
- 저항계를 사용하여 핀 1과 핀 2 사이의 전도도를 확인합니다.
- 와이어 끝에 있는 핀을 함께 가져오고 평행하게 가깝게 잡습니다. 지혈제를 와이어 중앙에 고정합니다. 그런 다음 지혈기를 회전시켜 와이어가 상당히 단단히 꼬이도록 합니다. 지혈제를 제거합니다.
- 핀 아래 2mm 길이의 꼬인 와이어에 집게를 끼우고 와이어를 90°로 구부립니다.
- 동일한 와이어를 집게 위로 다시 90° 뒤로 밀어 첫 번째 와이어에서 1mm 더 구부립니다.
- 작고 날카로운 가위로 꼬인 와이어를 45mm 굽힘 아래 3.5° 각도로 자릅니다.
- 각 헤드셋에 대해 이러한 양극(이중 핀 꼬임) 전극 중 두 개를 준비합니다(선택 사항, 두 번째는 첫 번째 헤드셋에 전기적 문제가 있는 경우 백업).
- 양쪽 끝에 납땜된 핀이 있는 와이어를 두 개로 절단하여 하나의 단일 기준 전극을 준비합니다(1.1-1.17단계, 그림 1A).
- 와이어를 7mm로 자릅니다.
- 끝 부분을 팁 아래로 1mm 구부립니다.
- 그런 다음 구부러진 1mm 길이의 와이어 끝을 집게로 덮고 집게 주위로 와이어를 단단히 돌려 작은 고리(직경 1mm)를 만듭니다.
- 와이어의 직선 부분에 수직으로 루프를 구부려 와이어 끝이 다시 바깥쪽을 가리키도록 합니다.
- 두 개의 바이폴라 전극과 단일 참조 전극을 6핀 받침대에 조립하여 바이폴라 전극 사이에 6mm 거리를 두고 나란히 있고 참조 전극이 중간 외부 구멍에 배치되도록 합니다(그림 1B).
메모: 또 다른 방법은 전극을 이식하고 제자리에 시멘트를 붙인 다음 핀을 받침대에 삽입하는 것입니다.
2. 입체 전극 이식
- 모든 수술 도구와 6핀 전극 어셈블리는 수술 전에 고압멸균으로 소독하십시오. 수술 중에는 멸균 수술 부위를 유지해야 하며 멸균 수술용 장갑을 사용해야 합니다. 수술 부위를 제외한 동물을 덮기 위해 멸균 커튼(예: Press n' Seal)을 사용하는 것이 좋습니다.
- 이유식 4주 후 수술을 위해 8주 된 VGAT-Cre 마우스(수컷과 암컷 모두 연령이 일치하는 수낭 GABA 수송체[VGAT] 유전자의 제어 하에 Cre 재조합효소를 발현)를 사용합니다. 수술 후 체중 감소를 측정할 수 있도록 수술 전 동물의 체중을 기록합니다.
- 인증된 이소플루란 기화기 또는 정밀 주사기 펌프, 통합 디지털 기화기 및 피드백 열 패드가 장착된 저유량 마취 시스템을 사용하십시오.
메모: 저유량 시스템은 동물의 크기에 비례하는 낮은 유속으로 마취를 유도 챔버 또는 입위 프레임의 콧방울을 통해 전달할 수 있습니다(70mL/분, 공기 중 이소플루란 농도는 유도의 경우 4%, 수술의 경우 2%). 마취를 줄이면 수술 중에 동물에게 도움이 될 뿐만 아니라 실험실 직원이 이소플루란에 노출될 위험도 줄어듭니다.
- 마취된 동물을 37°C로 예열된 가열된 패드에 올려 놓고 수술 중 따뜻하게 유지합니다. 피드백 제어 온도 시스템을 사용하는 경우 가볍게 윤활된 온도 프로브를 동물의 직장에 삽입하여 수술 중 온도 모니터링을 수행합니다.
- 이어바를 귀에 부드럽게 삽입하고 앞쪽 윗니를 앞니 바에 부드럽게 삽입하여 동물을 입정계 프레임에 장착합니다. 적절한 마취 전달을 위해 코 위에 콧방울을 놓습니다. 머리가 수평을 이루고 중앙에 있는지 확인하고 약간 프로브할 때 움직일 수 없는지 확인하십시오.
- 수분 공급을 위해 0.5mL의 노르모솔을 피하주사합니다.
- 각막 건조를 방지하기 위해 안구 윤활제를 바르십시오.
- 뒷다리 발가락을 꼬집은 후 금단 반사가 없어 마취 깊이를 모니터링한 다음 수술 중에 이소플루란을 1.5%-2.0%로 줄입니다.
- 수술 부위와 수술 부위 주변의 털을 뽑거나 이발기(면도기) 또는 제모 크림을 사용하여 제거하고 요오드와 에탄올을 교대로 3회 도포하여 피부를 소독하고 요오드로 마무리합니다. 수술 부위에서 머리카락을 제거하는 것은 해당 위치에서 마취를 유지할 수 있는 수단이 있는 경우에만 권장됩니다. 필요한 경우 알코올에 적신 면봉 어플리케이터를 사용하여 머리 주변 부위의 털을 제거합니다. 국소 진통제 부피바카인 0.05mL(0.25%)를 피하주사합니다.
- 메스를 사용하여 두개골을 절개한 다음 날카로운 수술 용 가위로 피부의 일부를 잘라내어 두개골을 노출시킵니다. 면봉을 사용하여 피부를 옆으로 밀어내고 시야를 방해하는 모든 근육과 아래 조직에서 두개골을 청소합니다.
메모: 우발적인 출혈을 멈추려면 출혈이 멈출 때까지 멸균 면봉으로 출혈 부위를 압박하십시오.
- 멸균 면봉을 사용하여 과산화수소로 두개골을 청소하여 두개골 봉합사와 브레그마와 람다를 모두 볼 수 있도록 합니다.
- 두개골을 완전히 건조시킨 다음 애플리케이터를 사용하여 셀프 에칭 치과 접착제 한 방울을 바릅니다. 두개골에 브러시로 바르고 60초 동안 기다린 다음 40초 동안 치과 자외선으로 경화합니다. 광택 있는 표면은 접착제가 두개골과 효과적으로 가교되었음을 나타냅니다.
메모: 이 단계는 헤드셋을 안전하게 부착하는 데 중요합니다.
- 0.031" 드릴 비트(0.79mm)를 사용하여 해마 깊이 전극(약 5,000rpm)을 이식하기 위해 양측으로 두 개의 버 구멍을 뚫습니다. lambda 뒤의 소뇌 위에 기준 전극을 위한 버 구멍을 하나 더 뚫습니다.
알림: 드릴을 뚫을 때 드릴을 천천히 내리고 뇌에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오.
- 전극의 좌표는 다음과 같습니다 (브레그마에서 mm) : 3mm 후방, 3mm 측면 및 3mm 깊이의 해마 전극; 및 6mm 후방, 0mm 측면 및 0mm 깊이 (경막하)의 소뇌 참조 전극.
- 정확도를 높이려면 입체로 장착된 드릴을 사용하고 브레그마를 만질 때 입체식 매니퓰레이터 X/Y축을 0으로 만듭니다 - 이것이 좌표에 대한 기준점입니다.
- 6핀 받침대에 모든 전극을 삽입하여 헤드셋을 조립하고 핀이 받침대 안으로 완전히 밀어 넣었는지 확인합니다. 받침대를 입체성 프레임의 전극 홀더에 장착합니다(그림 1B).
- 해당 버 구멍 위에 전극을 정렬합니다. 헤드셋을 천천히 내리고 전극을 버 구멍으로 유도하여 좌우 해마와 기준 전극에 있는 꼬인 양극성 스테인리스강 와이어 전극을 소뇌에 입체택식으로 이식합니다.
- 해마 트위스트 전극이 구멍 바로 위에 있을 때 Z축을 영점으로 만들고 -3.0mm로 천천히 낮춥니다.
- 두개골 표면과 전극을 치과 시멘트로 덮고 두개골 표면과 받침대 바닥 사이의 공간을 채웁니다. 피부 가장자리는 치과 시멘트에 인접하여 기본 조직이 노출된 상태로 유지되지 않습니다. 시멘트가 마르고 굳을 때까지 기다리십시오. 그런 다음 입체선 암에서 전극 홀더를 분리하고 받침대에서 홀더를 제거합니다.
- 진통제를 위해 0.1mL의 케토프로펜(1mg/mL, 피하[SC])을 주입하고 수분 공급을 위해 0.5mL의 노르모솔(SC)을 2차 투여하고 동물을 입위 골격에서 제거합니다.
- 37°C로 예열된 등온 패드를 종이 타월로 덮인 빈 사육장 안에 넣습니다. 완전히 깨어나면 동물을 침구와 부드러운 음식이 있는 깨끗한 우리에 넣고 사육장으로 돌려보냅니다. 이 시점부터 동물들은 서로의 헤드셋을 씹는 것을 방지하기 위해 단독으로 수용됩니다. 와이어 바 호퍼는 헤드셋이 끼는 것을 방지하기 위해 사용되지 않으며, 대신 물병은 케이지 상단 아래쪽에 묶여 있고 차우는 침구에 있습니다.
- 수술 후 72시간 동안 동물에게 부드러운 음식을 먹이고 체중 감소와 신체 상태 점수를 모니터링합니다. 탈수된 동물은 탈수된 경우(체중 감소, 피부 거칠림 증가, 움푹 들어간 눈) 0.5mL의 노모솔을 피하로 투여할 수 있습니다. 케토프로펜은 수술 후 2일 동안 하루 한 번 피하 투여할 수 있습니다(지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회[IACUC] 지침에 따른 진통제 요법 준수). 동물이 뇌파검사(EEG) 기록 시스템으로 옮겨지기 전에 4-7일 동안 케이지에서 완전히 회복할 수 있도록 합니다.
