생체내에 이미징 프로토콜 등의 루트 호감 다음과 같은 기본 감각 axons를 모니터가 설명되어 있습니다. 절차는 넓은 필드 형광 현미경 및 thy1 - YFP 유전자 변형 생쥐를 활용하고, CNS의 인터페이스와 PNS와 축삭의 상호 작용에서 4cm 이상의 축삭 재생의 반복 영상을 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
척추 루트 부상에 의해 부상을 기본 감각 axons 만성 통증과 영구 감각 상실로 이어지는, 척수로 재생하기 위해 실패합니다. 척수로 등의 루트 (DR) axons의 재생은 지느러미 루트 항목 영역 (DREZ), CNS와 PNS 사이의 인터페이스에 방지합니다. 신경 손상과 관련된 복잡한 변화가 사후 분석에서 유추되어 있기 때문에 DREZ에서 중생을 방지 분자 및 세포 사건에 대한 우리의 이해는 부분적으로 완전하지 않습니다. 같은 축삭 재생과 같은 동적 세포 공정, 최상의 각 생활 동물의 여러 관찰과 실시간 이벤트를 캡처하는 기술을 연구하고 있습니다. 순차적으로 생체내에서 뉴런을 모니터링하는 우리의 능력은 광학 마우스 트렌스 제닉의 혁명적인 혁신을 대폭 때문에 증가했다. thy1 - GFP 형질 전환 마우스의 몇 라인은, 뉴런의 일부가 유전자 뚜렷한 형광 색상으로 표시하는 개별 뉴런은 생체내 1 군데로 허용합니다. 이 생쥐는 근육 2-4과 5-7 두뇌의 생체내 이미징에 대해 광범위하게 사용되고 있고, 정적 분석을 확인할 수 없었다는 것을 생리적 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다. 생활 척수에서 뉴런의 이미징 연구는 최근에 시작했다. Lichtman와 그의 동료는 먼저 넓은 필드 현미경 8,9와 부상 등의 열 (DC) axons를 추적하여 가능성을 보여주었다. 깊이 위치 직류 axons의 생체내 이미징에서 다중 광자, microglia 및 혈관도 10 성취되었습니다. 지난 몇 년 동안, 우리는 넓은 분야 현미경과 thy1 - YFP 마우스의 H 라인을 사용하여 DR의 axons의 재생을 모니터 생체내 이미징에서 신청 개척했습니다. 이러한 연구는 DR의 axons은 척수 11 시간 재생 방해하는 이유에 대해 소설 가설 우리를 이끌고있다.
thy1 - YFP 마우스의 H 라인에서 뚜렷한 YFP + axons은 피상적으로 여러 axons 동시에 모니터링할 수 있도록하는, 위치가 결정됩니다. 우리는 DREZ에 도착 DR의 axons가 더 경추 척수에 비해 요추에 몇 군데 있다고 배웠습니다. 현재 보고서에서 우리는 재생 DR의 axons의 성공적인 장기 반복 영상을 확인하는 데 유용 발견되는 몇 가지 전략을 설명합니다. 이들은 반복 삽관법 및 호흡 중단을 제거하는 방법을 포함, 수술 - 관련 스트레스와 흉터 형성을 최소화하고, phototoxicity없이 높은 해상도에서 안정적인 이미지를 획득.
프로토콜
1. 현미경 설정하고 이미지 준비
- 우리의 이미지가 빠른 셔터 및 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어 냉각 CCD 카메라와 Leica MZ16 형광 stereomicroscope 구성되어 설정할 수 있습니다.
- thermostatically 제어 난방 패드를 준비하고 ° C 동물의 체온을 유지하는 동안, 그리고 수술에 따라 32.5 출력을 조정할 수 있습니다.
- 32.5 ° C로 수술 중 척수의 관개를 위해 사전에 따뜻한 살균 링어의 솔루션이나 인공 뇌척수 (ACSF).
- xylazine (8 MG / kg)과 케타민 (120 MG / kg) 칵테일의 intraperitoneal 주사와 함께 동물을 마취.
- 작은 동물 가위로 상위 다시 면도하고 목화 - 스쳐 면봉으로 면도 영역 제모 로션의 작은 방울을 확산. 분 후, 70 % 에탄올 젖었 거즈 스폰지를 사용하여 적용 로션을 제거합니다.
2. Laminectomy 및 L5 등의 루트 외과 노출
- 온수 (32.5 ° C) 패드에있는 동물을 놓고 70 %의 에탄올 젖었을 면봉으로 피부를 소독.
- 뒷면의 피부에 - stereomicroscope에서 명시야 조명에....
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토론
직접 살아있는 생쥐의 영상 DR 재생, 특히 그것이 이후 이미지 세션에 여러 침략 수술 및 마취 절차에 의해 다음 넓은 영역 축삭의 성장을 모니터링하는 상당한 등의 laminectomy을 필요로하기 때문에 도전이다. 몇몇 전략은 이러한 과제를 극복하기 위해 도움이되었습니다. 첫째, 성공적인 이미지는 마취와 출혈의 기간을 최소화하여 마우스 사망률 (약 25 %) 감소 필요하고, 세심한 수술 치료로. 사망률도 빠르게 삽관법이나 호흡기 중단없이 여러 이미지를 얻기위한 고속 카메라의 속도를 허용 설정을 사용하여 감소되었다. 노출 코드에 흉터의 축적을 방지하는 것도 중요했다. 이러한 collagenous 흉터는 영상 세션 사이 급속히 발전하고 두라 표면에 얇은하지만 불투명한 레이어를 형성합니다. 제거, 지루 이미지 세션을 연장하고 vasculature 및 axons 손상을 위험. 흉터 제거를위한 효과적인 전략은 단단히 노출 코드에 준수하고 흉터가 멤브레인보다는 두라에 축적하는 원인이되는 얇은 막 매트릭스를 적용하는 것이었다. 때문에.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 의견과 편집에 도움 박사 앨런 Tessler 감사합니다. 이 작품은 NIH NS062320에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| (2~4개월 나이, 성별)를 H 라인 thy1 - YFP | 잭슨 연구소 (바 하버, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed 분사, 살균 용액) | 로이드 연구소 (셰난도아, LA) | 4811 | 8 MG / kg |
| 케타민을 (케타민을 염산염 사출, USP) | Hospira 주식 회사 (레이크 포레스트, IL) | 2051 | 120 MG / kg |
| Buprenorphine (주사용 Buprenex) (0.05 밀리그램 / kg) | 레키트 Benckiser 제약 주식 회사 (리치몬드, VA) | 7571 | |
| 작은 동물 머리 가위 | 오스터 전문 (맥민빌, TN) | 76059-030 | |
| 제모 로션 | 처치 & 드와이트 공동 (프린스톤, NJ) | 베이비 오일과 나이르 | |
| 거즈 스폰지 | 피셔 과학 (피츠버그, PA) | 22-362-173 | |
| 커튼 - 날붙이 면봉 | 피셔 과학 (피츠버그, PA) | 14-960 - 분기 | |
| 1 ML 주사기 | 백톤, 딕슨과 회사 프랭클린 레이크스, NJ) | 309602 | |
| 피하 (서브 Q) 바늘, 26ga. | 백톤, 딕슨과 회사 (프랭클린 레이크스, NJ) | 305115 | |
| 스프링 가위와 집게 | 파인 과학 도구 (포스터 시티, CA) | ||
| 2.5 - mm 곡선 rongeurs | 파인 과학 도구 (포스터 시티, CA) | 16221-14 | |
| Lactated 링어의 사출 USP | B. 브라운 의료 주식 회사 (어바인, CA) | BBR - L7502 | |
| 멸균 생리 식염수 | APP 제약 (샴버그, IL) | 918610 | |
| 박막 합성 행렬 막 (Biobrane) | Bertek 제약 (모건, WV) | 62794-096-251 | |
| 인공 두라 | 고어 MVP 두라의 대체, WL 고어와 동료 (플라그 스 타프, AZ)을 배제 | 1MVP40 | |
| 5-0 실크 봉합 | Ethicon, 주식 회사 (서머빌, NJ) | K - 580 | |
| 상처 클립 | 퍼펙트 - ETS 브루노 (Burnea, 프랑스) | A75 | |
| 형광 stereomicroscope | Leica 마이크로 시스템즈 (Wetzlar, 독일) | MZ16 | |
| CCD 카메라 | 하마 마츠 (브리지, NJ) | 오르카 - Rx2 | |
| 온도 컨트롤러 | 세계 정밀 계측기 (사라소타, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph 소프트웨어 | 분자 장치 (서니 베일, CA) | ||
| 포토샵 | 어도비 시스템즈, 산호세, CA |
참고문헌
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, ....
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재인쇄 및 허가
