Impact of Direct Current Stimulation on Evoked Epileptic Seizures in Mouse Brain Slices(마우스 뇌 절편에서 유발된 간질 발작에 대한 직류 자극의 영향)

초록

출처: Lu, H., et al. 직류 자극 및 마우스 뇌 절편 준비에서 발작과 같은 활동의 다중 전극 어레이 기록. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 쥐 뇌 절편의 간질 발작에 대한 직류 자극(DCS)의 영향을 평가하기 위한 연구를 보여줍니다. 연결된 내측 시상(medial thalamus, MT)과 전대상피질(anterior cingulate cortex, ACC) 영역을 포함하는 뇌 절편은 다전극 배열(multielectrode array, MEA)에 배치됩니다. MT에 대한 전기 자극과 발작 유발 약물을 적용하여 ACC에서 간질 발작을 유도합니다. 그런 다음 DCS를 적용하여 유발 발작에 미치는 영향을 평가합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 다전극 어레이 레코딩을 위한 실험 용액 및 장비 준비

1. 인공 뇌척수액(인공 뇌척수액[aCSF]; 124 mM NaCl, 4.4 mM KCl, 1 mM_NaH2PO₃, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO₃ 및 10 mM 포도당, 95%_O2 및 5%_CO2로 거품 처리)을 준비합니다.
2. 두 가지 유형의 MEA 프로브, 즉 6 x 10 평면 MEA 및 8 x 8 MEA를 사용합니다. 전자의 프로브는 피질(cortex), 선조체(striatum) 및 시상(thalamus)을 구성하는 영역을 다룹니다. 후자의 프로브는 피질 영역만 덮습니다.
3. 60채널 사용 amp1,200 증폭에서 0.1Hz와 3kHz 사이로 설정된 대역 통과 필터가 있는 liifier. 10kHz 샘플링 레이트로 데이터를 수집합니다.
4. DCS용 MEA 챔버 내부에 두 개의 AgCl 코팅된 은선을 배치합니다. AgCl 코팅된 은선을 사용하여 절연 자극기에 의해 생성되는 전기장을 생성합니다.
5. 시상 자극을 위해 텅스텐 전극(직경, 127μm, 길이, 7.62cm, 8° AC 테이퍼 팁, 저항, 5MΩ)을 놓고 기준 전극을 MEA 챔버에 놓습니다. 펄스 발생기에 의해 제어되는 절연 자극기를 사용하여 텅스텐 전극의 전류를 전달합니다.

2. 브레인 슬라이스 준비

1. 4-8주 된 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하십시오. 동물을 에어컨이 설치된 방(21-23°C, 습도 50%, 12시간/12시간 조명/어둡게 주기, 오전 8:00에 점등)에 보관하고 음식과 물을 무료로 이용할 수 있습니다.
2. 1.1단계에서 준비한 aCSF 분취액 250ml를 얼음이 들어 있는 비커에 넣습니다. 동시에 95 % O₂ 및 5 % CO₂ 로 구성된 연속 가스를 공급하십시오.
3. 외과
   1. 유리 상자에 4% 이소플루란으로 동물을 약 3분 동안 마취합니다. 동물이 외과적 마취 깊이에 도달하면(발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는 것으로 나타남) 으깬 얼음으로 채워진 얕은 쟁반에 동물을 놓고 가위로 머리를 제거합니다.
   2. 두개골을 드러내고 남은 근육을 잘라냅니다. 다음으로, 롱거스를 사용하여 뇌에서 두개골의 등쪽 표면을 벗겨냅니다. 롱거를 사용하여 두개골의 측면을 다듬습니다. 모든 수술 기구를 75% 에탄올 용액으로 소독합니다.
   3. 주걱을 사용하여 뇌의 복부 표면을 따라 후각구와 신경 연결을 절단하고 뇌를 제거합니다. 참수 후 뇌를 얼음처럼 차가운 산소가 공급된 비커로 빠르게 옮깁니다.
4. MT-ACC Brain Slice
   의 준비 메모: MT에서 ACC로의 경로를 포함하는 슬라이스를 준비합니다.
   1. 각 반구의 정중선 옆으로 2.0mm 떨어진 두 개의 시상면으로 뇌 블록을 손으로 잘라 피질하 해부학적 구조를 표시합니다. 그런 다음 두 개의 각도로 자릅니다. 선조체에서 보이는 섬유 관과 평행하게 첫 번째 교차 절단을 만듭니다.
   2. 소뇌와 시각 피질 사이의 연결에서 복부에 있고 시상 대상과 평행한 전방 커미셔와 시관 사이의 중간 지점까지 두 번째 교차 절단을 만듭니다.
   3. 시아노아크릴레이트 접착제로 뇌 블록을 각진 판(~120°)에 부착하고 경로의 전환점 바로 위를 절단합니다. 플레이트를 펼치고 평평하게 펴서 비브라톰의 챔버 스테이지에 붙입니다.
   4. 내측 시상-ACC 뇌 절편(500μm 두께)을 만든 다음 얼음처럼 차가운 산소가 공급된 aCSF에 담급니다. 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 산소화된 aCSF와 함께 연속 관류(12ml/분) 상태에서 32°C에서 1시간 동안 유지합니다.

3. 다전극 어레이 기록을 위한 관류 챔버 준비

1. 관류 챔버의 준비
   1. MEA 프로브를 다중 채널 시스템에 놓고 두 개의 별도 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 프로브를 연동 펌프에 연결합니다. 한 튜브를 사용하여 aCSF를 MEA 챔버 내로 안내하고 다른 튜브를 사용하여 aCSF를 챔버 밖으로 안내합니다. 마지막으로, 따뜻한(29-30°C) 산소화된 aCSF(8ml/분)로 제제를 지속적으로 관류합니다.
2. 브레인 슬라이스를 MEA로 전송합니다. 젖은 면봉을 사용하여 MEA의 뇌 절편을 누릅니다. ACC가 전극 위쪽을 향하도록 뇌 절편을 조심스럽게 움직입니다.
3. 슬라이스 앵커 키트와 홀드다운을 사용하여 브레인 슬라이스를 누릅니다. 이 단계는 슬라이스와 전극 사이의 양호한 전기 연결을 보장합니다.

4. DCS에 의한 전기장 생성

참고: 전기장 방향의 정의는 ACC에서 축삭 축의 방향을 기반으로 했습니다. 수상돌기 및 솜 구획의 방향은 골지 염색을 사용하여 확인되었습니다.

1. AgCl 전극(양극으로 정의됨)을 ACC 근위에 배치하고 다른 전극(음극으로 정의됨)을 ACC 원위부에 배치합니다. MEA에 의해 두 개의 자기장 방향(ACC 축삭 섬유에 평행 및 수직)에 의해 생성되는 전계 강도를 기록하고 자극기를 사용하여 전기장의 전류를 전달합니다.
2. AgCl 전극의 거리(약 1.5-2cm)를 고정하고 자극기의 전류 강도를 조정하여 DCS를 0.5mA에서 2mA 사이로 만듭니다.

5. 전기적으로 유도된 피질 시냅스 반응

참고: 프로그래밍 가능한 전기 자극 발생기가 직사각형 이위상 전류 펄스를 생성하는 MT의 전기 자극에 의해 ACC에서 시냅스 반응을 유도합니다.

1. 위의 섹션 3을 반복합니다.
2. MT에 텅스텐 전극을 놓고 바이폴라 텅스텐 전극을 통해 자극기에서 슬라이스의 시상 영역으로 펄스를 전달합니다.
3. 다양한 전류 강도를 사용하여 ACC 응답을 유도하는 임계값을 결정합니다. 여기서는 ±150μA의 강도와 200μsec의 지속 시간을 사용하여 대부분의 슬라이스에서 ACC에서 80%의 최대 응답을 이끌어냈습니다.
4. 최적의 반응 프로파일을 얻기 위해 MT-ACC 슬라이스에서 thalamocingulate pathway(MT에서 corpus callosum까지)를 따라 텅스텐 전극을 이동합니다.
5. ACC 반응을 10-20회 스윕하고 소프트웨어를 사용하여 MT 자극에 의해 유발된 모든 ACC의 평균을 자동으로 구합니다. 그 결과 MT-ACC 경로에 의한 MT 자극으로 유도된 ACC의 시냅스 반응이 나타납니다.

6. 전기적으로 유도된 발작과 같은 활동

참고: 발작과 같은 활성은 4-아미노피리딘(4-AP; 250μM) 및 바이큐큘린(5μM)의 적용에 의해 유도되었습니다. 이전의 시간 대조군 연구에서는 약물 투여 후 2-3시간 후에 최대적이고 안정적인 반응이 나타나는 것으로 나타났습니다.

1. 위의 섹션 5를 반복합니다.
2. 관류 용액에 약물을 첨가합니다. 4-AP(250μM) 및 바이큐큘린(5μM)을 사용합니다. 약물을 균일하게 혼합하고 2-3 시간 동안 관류를 계속하십시오.
3. 발작과 같은 활동을 촉진하려면 관류 펌프를 비교적 빠른 관류 속도(8ml/분)로 유지하며, 이는 pH 구배의 축적을 방지하는 데도 도움이 될 수 있습니다.
4. MT에 텅스텐 전극을 놓고 전기 자극(150μA, 200μsec 지속 시간)을 전달하여 ACC 반응 프로파일을 얻습니다.
5. 10-20회 스윕하고 응답의 평균을 구합니다.
6. 관류 용액을 새 aCSF로 교체하여 약물을 씻어냅니다. 6.5단계를 반복합니다.

7. 유발 된 피질 반응에 대한 DCS의 테스트 효과

1. 섹션 3과 4를 반복합니다. MEA 챔버 내부에 배치된 두 개의 평행한 AgCl 코팅된 은선 사이에 전류를 통과시켜 균일한 전기장이 생성되는지 확인합니다. 문제가 없는 경우 DCS는 0.5mA에서 2mA 사이로 유지됩니다.
2. DCS를 끄고 텅스텐 전극을 배치하여 시상을 자극합니다(±150μA, 200μsec 지속 시간). ACC에서 최대 시냅스 반응을 얻으려면 10-20회 스윕하고 반응의 평균을 구합니다.
3. DCS(2mV/mm DCS 강도)와 시상 자극(350μA, 200μsec 지속 시간)을 동시에 켭니다. DCS 중 시상 자극 유발 ACC 반응의 진폭 변화를 평가합니다.
4. DCS를 끄고 관류 용액에 4-AP(250μM) 및 바이큐컬린(5μM)을 추가합니다. 그런 다음 2-3 시간 동안 기다립니다. 약물이 뇌 절편에 영향을 미치면 뇌 절편은 피질 발작 반응을 일으킵니다.
5. ACC 반응을 10-20회 스윕한 다음 전기적으로 유발된 피질 발작 반응의 진폭과 지속 시간을 측정합니다.
6. 7.5단계 후 DCS(2mV/mm DCS 강도)와 시상 자극(150μA, 200 duration μsec)을 동시에 켭니다. DCS 적용 중 유발된 피질 발작 반응의 진폭 및 지속 시간의 변화를 평가합니다.
7. 관류 용액을 새 aCSF로 교체하여 약물을 씻어내고 7.2 및 7.3단계를 반복합니다.
8. 모든 기록 데이터를 수집하고 데이터를 다양한 실험 조건으로 그룹화합니다. 다양한 실험 조건에서 대뇌피질 발작 반응의 진폭과 지속 시간을 평가합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마 취:
이소플루란	Halocarbon 제품 공사	재질 보기 NDC 12164-002-25	4%
aCSF (총:1L):
D(+)-포도당	머 크	1.08337.1000	10 밀리미터미터
탄산수소나트륨	머 크	1.06329.0500	25 밀리미터미터
소금	머 크	1.06404.1000	124 밀리미터미터
(+)-나트륨 L-아스코르브산염, >=98%	시그마	A4034-100지	0.15g/2 콘씨
황산마그네슘, 무수, ReagentPlus	시그마	M7506-500G	2 밀리엠
염화칼슘 이수화물	머 크	1.02382.1000	2 밀리엠
나트륨 이수소 인산염 일 수화물	머 크	1.06346.1000	1 밀리엠
염화칼륨	May & Baker LTD Dagenham, 영국	MS 7616 (영문	4.4 밀리미터.
마약:
(+)-바이큘린	토크리스	130	aCSF에서 5μM
4-아미노피리딘	토크리스	940	250μM(aCSF)
Brain slice 준비:
비브라톰	비브라톰	1000 시리즈	500μm 두께의 슬라이스로 블록 슬라이싱
MEA 시스템:
다중 전극 어레이(MEA) 프로브: 6 x 10 평면 MEA	다중 채널 시스템	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	전극 직경, 30 μm; 전극 간격, 500 μm; 임피던스, 200 Hz에서 50 kΩ
MEA(Multielectrode Array) 프로브: 8 x 8 MEA	아얀다 바이오시스템즈	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	피라미드 모양의 전극; 직경, 40 μm; 팁 높이, 50 μm; 전극 간격, 200 μm; 임피던스, 200 Hz에서 1,000 kΩ
60채널 앰프는 1,200X 증폭에서 0.1Hz와 3KHz 사이로 설정된 대역 통과 필터와 함께 사용되었습니다	다중 채널 시스템	MEA-1060-BC
10KHz 샘플링 속도의 MC Rack 소프트웨어	다중 채널 시스템		데이터 수집 및 기록을 위한 소프트웨어
펄스 발생기의 제어	다중 채널 시스템	재질 보기 STG 1002
Slice 앵커 키트 및 홀드다운	워너 인스트루먼트	SHD-26H/10; WI64-0250
연동 펌프-minipuls3	길섬	MINIPULS3	관류 속도 : 8 ml/min
자극 시스템:
절연 자극기	A-M 시스템	모델 2100	±350μA의 강도, 200μsec의 지속 시간
텅스텐 전극	A-M 시스템	575300	시상에 놓임

) 의 명