충격관 장치를 이용한 뇌 절편에 외상성 손상 유도

초록

출처: Campos-Pires, R., et al. 폭발 외상성 뇌 손상의 소설 체외 모델. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 충격관 장치를 사용하여 제어된 가압을 통해 폴리머 다이어프램을 파열시켜 충격파를 생성합니다. 충격파는 안전한 가방에 들어 있는 뇌 조각에 충격을 가하여 뇌 조각에 외상성 손상을 입힙니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 해마 유기형 슬라이스 준비 및 배양

참고: 이 프로토콜은 유기형 해마 절편을 생산할 수 있습니다. 이상적으로는 한 번에 3마리 이상의 동물을 안락사시키고 해부하여 각 단계를 신속하게 수행하고 슬라이스의 품질을 손상시키지 않도록 해야 합니다. 전체적으로 무균 기술을 사용하십시오.

1. 해부 프로토콜을 시작하기 전에 다음 단계를 수행했는지 확인하십시오.
   1. 0.22μm 필터를 사용하여 모든 용액을 미리 준비하고 여과하여 멸균합니다.
   2. 보관 용기와 페트리 접시를 항상 젖은 얼음 위에 놓아 금속 방열판에 보관하여 보관 중과 뇌 해부 및 해마 슬라이스 준비 전반에 걸쳐 용액을 4°C로 유지하십시오.
   3. 모든 금속 기구, 반지 및 종이 티슈를 오토클레이브합니다.
   4. 프로토콜의 각 단계에 사용할 모든 기기와 재료가 사용할 준비가 되어 있고, 미리 배치되어 있으며, 70% 에탄올이 분무되었는지 확인합니다. 그런 다음 식히고 말리십시오.
2. 생후 5-7일 된 C57BL/6N 새끼 생쥐를 경추 탈구로 안락사시키고 70% 에탄올에 적신 멸균 종이 티슈로 피부 표면 전체를 잠시 닦습니다. 피부를 두드려 말리고 Mayo 가위를 사용하여 강아지의 목을 베십시오.
3. 홍채 가위로 두피 피부를 후두부에서 시작하여 근처에서 끝나는 머리 정중선을 따라 자르고 측면으로 집어넣습니다.
4. Vannas 가위의 끝을 foramen magnum에 삽입하고 횡동 부비동을 따라 뼈를 두 개의 작은 측면 절개를 만든 다음 정중선을 따라 후각 구까지 두개골을 자르고 이 영역의 정중선에 수직으로 두 개의 작은 절단을 만듭니다.
5. 미세한 곡선 집게를 사용하여 뼈의 플랩을 정중선에서 측면으로 집어넣습니다. 작은 주걱으로 뇌를 조심스럽게 제거하고 "해부 매체"가 들어 있는 90mm 실리콘 엘라스토머로 코팅된 페트리 접시에 옮깁니다.
   메모: 해부 매체는 Gey의 평형 염 용액(5mg/mL D-글루코스, 1% 항생제-항진균 용액, 10,000 units/mL 페니실린, 10 mg/mL 스트렙토마이신 및 25 μg/mL 암포테리신 B)입니다.
6. 소뇌를 제거하고 면도날을 사용하여 정중선을 따라 대뇌 반구를 분리합니다. 주걱을 사용하여 대뇌 반구를 신선하고 얼음처럼 차가운 해부 매체로 채워진 새로운 90mm 실리콘 엘라스토머 코팅된 페트리 접시로 옮깁니다. 한 세션에 두 마리 이상의 동물을 사용하는 경우 1.2-1.6단계를 반복합니다.
7. 실체현미경으로 면도날로 후각구와 전두엽 피질의 끝을 자르고 끝이 가는 집게를 사용하여 대뇌 피질과 나머지 대뇌 조직을 분리합니다. 이 단계는 해마를 피질 조직의 내측 표면에 노출시킵니다. 이 단계부터는 층류 조직 배양 후드(자외선 살균 및 70% 에탄올 용액으로 세척)를 사용합니다.
8. 얼음처럼 차가운 해부 매체를 평평한 플라스틱 도마 디스크에 바르고 주걱을 사용하여 피질의 내측 표면이 위를 향하고 해마의 축이 도마의 축에 수직이 되도록 뇌 조직을 디스크에 배치합니다.
9. 끝이 가는 파스퇴르 피펫을 사용하여 도마 디스크에서 해부 매체를 최대한 제거합니다.
10. 조직 다지기를 사용하여 뇌를 400% 절단 속도와 힘으로 50μm 조각으로 자릅니다.
    메모: 이 단계는 뇌 조직이 해부 매체에 잠기지 않기 때문에 가능한 한 빨리 완료해야 합니다.
11. 실리콘 엘라스토머로 코팅된 페트리 접시의 박리 매체를 얼음처럼 차가운 새 매체로 교체합니다.
12. 조직 다지기 작업이 끝나면 뇌 조직을 새로운 해부 매체에 조심스럽게 담그고 직선 블레이드 메스를 사용하여 절단된 조직을 90mm 실리콘 엘라스토머로 코팅된 페트리 접시에 다시 옮깁니다.
13. 실체현미경으로 미세한 끝집게를 사용하여 피질 절편을 조심스럽게 분리합니다. 각 절편에 대해 해마의 형태와 해부 또는 절단으로 인한 잠재적인 조직 손상이 있는지 검사합니다.
14. 끝이 가는 집게와 작은 바나스 가위를 사용하여 해마를 내후각 피질과 핌브리아에서 분리합니다. 일반적으로 반구당 약 6-8개의 해마 조각이 생성됩니다.
15. 자른 파스퇴르 피펫을 사용하여 최대 6개의 해마 조각을 조직 배양 삽입물에 옮기고 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 슬라이스가 몇 밀리미터 간격으로 퍼져 있는지 확인합니다(이렇게 하면 각 슬라이스를 개별적으로 이미지화할 수 있습니다).
16. 즉시 얼음처럼 차가운 "성장 배지"를 각 페트리 접시의 바닥, 조직 배양 삽입물 아래, 조직 배양 삽입물 테두리 바로 아래에 추가합니다.
    메모: 성장 배지는 50% 최소 필수 배지 독수리, 25% 행크스 균형 소금 용액, 25% 말 혈청, 5mg/mL D-글루코스, 2mmol/L L-글루타민, 1% 항생제-항진균 용액 및 10mmol/L HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)를 함유하며, 수산화나트륨으로 pH 7.2로 적정합니다.
17. 해부 다음 날과 그 후 2-3일마다 성장 배지를 교체하십시오(37°C에서 성장 배지 사용). 성장 배지가 충분히 첨가되었는지 확인하되 조직 배양 삽입막 위로 넘쳐서 조직 절편의 생존력을 손상시킬 수 있을 정도로 많이 첨가되지 않도록 합니다.
18. 실험에 사용하기 전에 조직 조각을 공기 중 이산화탄소가 5%인 37°C의 가습 인큐베이터에 12-14일 동안 보관하십시오.

2. 실험적 폭발 TBI 프로토콜을 위한 해마 유기형 슬라이스 준비

참고: 이미징을 제외한 이 섹션의 단계는 층류 조직 배양 후드에서 수행됩니다.

1. 맞춤형 스테인리스 스틸 링을 6웰 플레이트(웰당 하나)에 삽입합니다.
   참고: 링에는 노치가 있는 테두리(12시 위치에 있어야 함)가 있고 웰 내부에 꼭 맞는 반면 조직 배양 인서트는 이 테두리에 쉽게 맞습니다. 고리를 살균 소독제로 세척하고, 정제수로 철저히 헹구고, 고압 멸균하고, 미리 식히십시오.
2. 6웰 플레이트의 웰을 프로피듐 요오드화물이 함유된 예열된(37°C) 무혈청 "실험용 배지"로 채웁니다.
   메모: 프로피듐 요오드화물을 사용한 실험 배지는 75% 최소 필수 배지 독수리, 25% 행크스의 균형 잡힌 염 용액, 5mg/mL D-글루코스, 2mmol/L L-글루타민, 1% 항생제-항진균 용액, 10mmol/L HEPES 및 4.5μmol/L 프로피듐 요오드화물, 수산화나트륨으로 pH를 7.2로 적정했습니다.
3. 중간 레벨이 링의 노치 위에 도달하지 않는지 확인하십시오. 링이 있는 6-well 플레이트를 1시간 동안 인큐베이터로 다시 옮겨 조직 배양 삽입물이 이식되기 직전에 배지가 37°C가 되도록 합니다.
4. 35mm 페트리 접시의 유기형 절편이 있는 조직 배양 삽입물을 링이 있는 6웰 플레이트와 겸자가 있는 실험 배지로 옮깁니다.
5. 영구 마커 펜으로 3시 방향의 인서트 림에 점을 만듭니다.
   메모: 삽입물은 실험 중에 6웰 플레이트에서 제거됩니다. 이 단계는 충격파 노출 후 인서트를 원래 위치로 되돌리는 것을 용이하게 하고 프로토콜 전체에서 각 슬라이스를 쉽게 추적할 수 있습니다.
6. 각 6-well 플레이트에 고유한 이름 및 날짜를 라벨링하고 각 플레이트의 웰 지도를 만들어 각 웰(예: A, B, C 등)과 각 웰의 각 슬라이스(예: 1, 2, 3 등)의 이름을 지정하여 각 슬라이스가 고유 식별자(예: A1, A2, A3 등)를 갖도록 합니다.
7. 이미징 직전 1시간 동안 6-well 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 슬라이스가 37°C.
   상태인지 확인합니다. 메모: 조직 배양 삽입막 아래에 넘쳐나는 배지 또는 기포는 슬라이스의 생존력을 손상시킬 수 있습니다.
8. 실험 배지로 옮긴 후 1시간 후, 적절한 여기(BP 535/50nm) 및 방출(LP 610nm) 필터가 장착된 형광 현미경(2X 대물렌즈, NA 0.06)을 사용하여 각 슬라이스를 개별적으로 이미지화하여 손상 프로토콜이 수행되기 전에 슬라이스 상태를 평가합니다.
   노트: 이 단계에서 촘촘한 붉은 염색 영역을 보이는 절편은 생존력이 저하된 것으로 간주되어야 하며 추가 분석에서 제외해야 합니다(이는 일반적으로 생성된 총 절편 수의 10% 미만을 나타냄). 슬라이스가 인큐베이터 외부에 있는 시간을 최소화하기 위해 가능한 한 신속하게 순차적으로 이미징을 수행해야 합니다(일반적으로 6웰에서 이미징하는 데 30분 미만이 소요됨).
9. 6웰 플레이트의 뚜껑을 항상 켜두십시오. 뚜껑 안쪽에 결로 현상이 생길 수 있습니다. 이 경우 낮은 설정에서 헤어드라이어를 잠시 사용하십시오.
10. 모든 이미징 조건이 다른 날과 실험 간에 동일한지 확인합니다.
    메모: 이미징의 목적은 조직 형광을 정량화하는 것입니다. 따라서 이 단계는 결과의 재현성을 보장하고 데이터를 비교할 수 있도록 하는 데 중요합니다.

3. Hippocampal Organotypic Slices를 사용한 조직 배양 삽입물의 침수 및 운송

1. 이미징 직후, 층류 후드에서 겸자를 사용하여 6웰 플레이트에서 하나의 조직 배양물을 꺼냅니다.
2. 95% 산소와 5% 이산화탄소로 갓 거품을 일으킨 20mL의 따뜻한(37°C) 실험용 매체로 미리 채워진 멸균 폴리에틸렌 백(3" x 5")에 인서트를 조심스럽게 옮깁니다.
   메모: 산소 및 이산화탄소가 풍부한 실험 매체를 Dreschel 병 내부의 소결 유리 버블러를 사용하여 95% 산소 및 5% 이산화탄소로 최소 40분 동안 버블링하고 박테리아 필터와 멸균 충전 튜브(127mm)가 부착된 20mL 주사기를 사용하여 층류 조직 배양 후드 내부의 멸균 폴리에틸렌 백으로 옮겼습니다. 백을 즉시 밀봉하고 조직 배양 삽입물을 옮기기 최소 1시간 전에 37°C 인큐베이터로 옮깁니다.
3. 각 멸균 백에 올바르게 라벨이 부착되어 있는지 확인하십시오(플레이트 및 웰 식별 포함). 각 조직 배양 삽입물에 대해 이 단계를 반복합니다. 멸균 백을 밀봉할 때 기포를 조심스럽게 제거합니다(백 상단을 비틀고 플라스틱 클램프를 적용하여 안전하게 수행).
4. 조직 배양 인서트가 있는 멸균 백과 실험용 배지가 있는 6웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다.
5. 1시간 후, 충격파 노출 프로토콜 전반에 걸쳐 유기형 슬라이스를 생리학적 온도로 유지하기 위해 37°C에서 탈이온수로 채워진 온도 조절 상자 내부의 플라스틱 상자에 조직 배양 삽입물이 포함된 멸균 백을 조심스럽게 포장합니다.

4. 충격 튜브 및 해마 유기형 슬라이스 충격파 노출의 준비

1. 강철 발가락 보호 장화, 실험실 가운, 장갑을 착용하고 충격 튜브를 준비하고 충격파를 노출시킵니다.
2. 멸균 백 홀더 프레임을 쇼크 튜브 원위 플랜지에 볼트로 고정하고 중앙 구멍이 쇼크 튜브 배출구와 정렬되도록 합니다(블랭킹 로드 사용).
3. 두 개의 압력 변환기를 방사형으로 장착합니다: 센서 1은 구동 섹션의 중간 부분에 있고 센서 2는 쇼크 튜브의 말단 플랜지에 있습니다(그림 1A). 전류 소스 전원 장치를 통해 압력 변환기를 오실로스코프에 연결합니다.
4. 모든 쇼크 튜브 해제 밸브와 유량 제어 장치가 닫혀 있는지 확인하십시오.
5. 외부 압축 공기 라인을 열고 솔레노이드 밸브를 2.5bar로 충전합니다.
6. 압축 공기 실린더 안전 밸브를 열고 압력 조절기를 천천히 열어 압력을 약 5bar.
   로 높입니다. 알림: 이 레귤레이터에 설정된 압력은 가장 높은 다이어프램 파열 압력보다 약간 높아야 합니다.
7. 23μm 두께의 폴리에스터 시트를 10 x 10cm2 정사각형으로 절단하여 다이어프램을 준비합니다. 오토클레이브 테이프를 사용하여 핸들을 준비하고 각 다이어프램의 상단과 하단에 붙입니다.
8. 브리치에 하나의 다이어프램(이중 브리치 - 단일 다이어프램 구성의 단일 슬롯) 또는 두 개의 다이어프램(이중 브리치 - 이중 다이어프램 구성의 두 슬롯)을 배치합니다(그림 1B).
9. 다이어프램을 중앙에 놓고 4개의 M24 볼트와 너트를 사용하여 클램핑하고, 대각선 대칭 방식으로 순차적으로 고정하고, 다이어프램에 주름이 생기지 않도록 합니다.
10. 각 멸균 백을 홀더 프레임의 수직 위치에 개별적으로 고정하여 유기형 해마 절편이 있는 조직 배양 삽입물의 표면이 충격 튜브 배출구를 향하고 조직 배양 삽입물이 멸균 백 내부의 중앙에 오도록 합니다(그림 1C). 멸균 백이 단단히 고정되어 견고하고 균일한 고정을 보장하는지 확인하십시오.
11. 쇼크 튜브에 압력을 가할 때 귀마개와 보안경을 착용하십시오. 전류 소스 전원 장치와 오실로스코프를 켜서 충격파 데이터(수집 속도 50메가-샘플/초, 레코드 길이 20ms, 100만 포인트)를 획득하고 솔레노이드 밸브를 닫습니다.
12. 쇼크 튜브 제어판의 유량 제어 손잡이를 사용하여 단일 다이어프램 구성의 경우 쇼크 튜브의 드라이버 볼륨 섹션을 천천히 가압하거나 이중 다이어프램 구성의 경우 쇼크 튜브의 드라이버 볼륨 섹션과 이중 브리치 섹션 모두에 천천히 압력을 가합니다.
    메모: 단일 다이어프램 구성의 경우 파열 압력은 다이어프램 재료와 두께에만 의존하며 재료 파열 압력에 도달하면 다이어프램이 자발적으로 파열됩니다. 이중 다이어프램 구성의 경우, 파열 압력은 드라이버와 이중 브리치 챔버 모두의 가스 압력 차이에 따라 달라지며, 다이어프램이 제어 된 방식으로 파열되기 위해 목표 압력에 도달하면 이중 브리치 안전 밸브가 수동으로 열립니다.
13. 다이어프램이 파열되자마자(큰 소리 발생) 흐름 손잡이를 사용하여 압축 공기 흐름을 빠르게 닫고 솔레노이드 밸브를 엽니다.
    메모: 드라이버 섹션의 총 부피는 블랭킹 세그먼트를 삽입하여 수정할 수 있으므로 더 넓은 범위의 충격파 피크 과압 및 지속 시간을 얻을 수 있습니다. 충격파 매개변수의 이상적인 조합은 조직 손상을 일으키기에 충분해야 하지만 조직 배양이 삽입되거나 멸균 백, 뒤틀림 또는 파열을 유발할 정도로 높아서는 안 됩니다.
14. 각 멸균 백에 조직 배양액을 노출시키고 단일 충격 튜브 웨이브에 삽입한 다음 상자에서 새 멸균 백을 꺼내 홀더 프레임에 고정하기 전에 즉시 열 조절 상자에 다시 넣습니다. 37°C 미만의 온도가 부상 발생을 방해할 수 있으므로 실험 매체가 냉각되는 것을 방지하기 위해 4.10–4.14단계를 가능한 한 부드럽고 신속하게(몇 분 이내) 수행해야 합니다.
15. 모든 조직 배양 삽입물이 충격파(또는 가짜 프로토콜)에 노출되면 원래의 6-well 플레이트와 해당 웰(층류 조직 배양 후드 내부)에 다시 넣고 인큐베이터로 돌아갑니다.
16. 추가 이미징이 있을 때까지 공기 중 5% 이산화탄소가 있는 37웰 플레이트를 인큐베이터에 보관하십시오.
17. 각 실험에 대한 가짜 컨트롤과 슬라이스 충격파 노출을 포함합니다.
    메모: 샴 슬라이스는 충격파에 노출된 슬라이스와 동일하게 처리되지만(실험용 매체와 함께 멸균 백에 밀봉되어 동일한 온도 조절 상자에 담긴 충격 튜브 실험실로 운송되고 동일한 기간 동안 금속 프레임에 매달려 있음) 쇼크 튜브는 발사되지 않습니다.

결과

그림 1: 멸균 백 홀더 프레임이 있는 쇼크 튜브 장치의 개략도. (A). 쇼크 튜브는 3.8m 길이의 스테인리스 스틸 튜브로, 1.22m 길이의 3 개의 섹션으로 구성되어 있으며 개스킷과 플랜지로 연결되며 내부 직경은 59mm입니다. (B) 삽입은 이중 브리치 어셈블리를 보여줍니다. 하나 또는 두 개의 Mylar 다이어프램은 고무 O-링으로 제공되는 씰로 어셈블리에 고정할 수 있습니다. (C) 멸균 백 홀더 프레임. 프레임의 몸체는 쇼크 튜브 배출구와 정렬된 중앙 원형 구멍(직경 59mm)이 있는 두 개의 금속판으로 구성되어 있습니다. 두 개의 금속판 사이에 두 개의 얇은(4mm) 실리콘 엘라스토머 시트가 장착됩니다. 이 시트의 목적은 멸균 백을 고정하기 위해 균일하고 미끄럽지 않은 표면을 제공하는 것입니다. 가방과 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Geys 균형 잡힌 소금 용액	시그마 영국	G9779
D- 포도당	시그마 영국	G8270
항생제/항진균제	시그마 영국	A5955
최소 필수 매체 독수리	시그마 영국	M4655
행크스 균형 잡힌 소금 용액	시그마 영국	H9269
호스 세럼	시그마 영국	H1138 (영문
L-글루타민	시그마 영국	G7513
헤페스	VWR Prolabo, 벨기에	441476엘
수산화나트륨	시그마 영국	에스-0945
조직 배양 삽입물	밀리셀 CM 30mm 저높이 Millipore	PICM 조직 50
6웰 플레이트	NUNC, 덴마크	140675
프로피듐 요오드화물	시그마 영국	P4864
멸균 폴리에틸렌 백 - Twirl'em 멸균 샘플 백	피셔브랜드	01-002-30
Portex Avon Kwill 필링 튜브 5"(127mm)	Smiths 의료 용품	E910
Epifluorescence microscope (에피 형광 현미경	NIKON Eclipse 80i, 영국
현미경 대물렌즈	Nikon Plan UW magn. 2x, 개구수 0.06, WC 7.5mm
현미경 필터	니콘 G-2B (롱패스 방출)
Mylar 전기 절연 필름, 304mm x 200mm x 0.023mm	RS 컴포넌트 영국	Tel.: 785-0782
압력 트랜스듀서	Dytran 인스트루먼트 Inc.	2300V1
티슈 다지기	Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, 영국.	Mcllwain 티슈 초퍼
실리콘 엘라스토머	다우코닝, 미국	실가드 184

) ) 시리즈