아밀로이드 펩타이드 주입을 통한 제브라피시 뇌의 알츠하이머병 모델 확립

초록

Bhattarai, P., et al. 성인 제브라피시 뇌의 아밀로이드-β42 독성 및 신경 퇴행 모델링. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 알츠하이머병에서 볼 수 있는 신경 손상을 모방하여 아밀로이드 독성을 생성하기 위해 성인 제브라피쉬의 전뇌에 단량체 아밀로이드 펩타이드를 주입하는 절차를 보여줍니다

프로토콜

1. Aβ42 펩티드의 제조

1. 자동화된 고체상 펩타이드 합성기의 커플링 시약으로 표준 9-플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc) 화학을 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로노ium헥사플루오르포스페이트(HBTU)와 합성하여 펩타이드(표 1 참조)를 합성합니다. 합성 스케일은 100 μmol이었다.
2. 자동 펩타이드 합성기에 500mg의 Fmoc-protected 수지를 고체상으로 로드합니다(0.2mmol/g의 로딩 용량). 용존 Fmoc으로 보호된 아미노산을 필요한 부피로 0.5M의 농도로 로드하고 각 synthesizer에 대해 계산된 대로 로드합니다.
   메모: 계산은 각 Fmoc으로 보호된 아미노산을 두 번 결합하고 각 구성 요소의 5배를 수지에 결합할 수 있도록 수행됩니다.
3. 펩타이드 합성에 필요한 시약을 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킵니다. 예를 들어, 0.48M, 45% v/v N-메틸모르폴린(NMM)(염기) 및 5% v/v 무수아세트산(캡핑 혼합물)의 농도로 활성제 HBTU를 준비하여 비반응 아미노기를 캡핑합니다.
4. 트리플루오로아세트산(TFA): 트리이소프로필실란(TIS): 물: 90(v/v)에서 디티오트레이톨(DTT): 5(v/v): 2.5(v/v): 2.5(m/v) 4시간 동안 10mL를 사용하여 10mL를 사용합니다.
5. 절단물 혼합물을 100mL의 얼음처럼 차가운 디에틸 에테르에 첨가하여 절단된 생성물을 침전시킵니다. 공극 크기가 0.45μm인 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 필터가 포함된 여과 장치를 통과시키고 20mL의 얼음처럼 차가운 디에틸 에테르로 세척합니다.
6. 여과지에서 여과된 펩타이드를 수집하고 침전된 펩타이드 100mg을 5mL 증류수 탈이온수(아세토니트릴)에 1:1로 용해합니다.
7. 비드 크기가 10μm인 다공성 폴리스티렌 디비닐벤젠 컬럼이 장착된 반분취 HPLC에서 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 정제합니다.
   1. 컬럼을 예열하고 컬럼 가열 장치를 사용하여 50°C로 유지합니다. 자동 분획 분취기를 사용하여 4mL/분에서 25분 동안 5%에서 100% 용매 B까지의 그래디언트를 적용하여 모든 주요 분획을 수집합니다
      메모: 용매 A는 물에서 0.1% TFA이고 용매 B는 아세토니트릴에서 0.1% TFA입니다.
   2. 220nm에서 크로마토그램을 모니터링하고, 적절한 피크를 수집하고, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 사용하여 분석합니다.
8. 220nm에서 분석용 역상 초고압 액체 크로마토그래피(UPLC)로 순도를 확인하고 자외선(UV) 검출기로 모니터링하면서 시료를 분석 C18 컬럼(비드 크기 1.7μm)에 통과시킵니다. 질량 spectrometry.
   에 의하여 펩티드 제품을 확인하십시오 메모: UPLC는 전기 분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS) 및 탠덤 사중극자 검출기와 연결됩니다.
9. 푹신한 분말에 0.052mbar의 진공을 적용하여 둥근 바닥 플라스크에서 원하는 펩타이드의 올바른 분획을 동결건조합니다. 진공 펌프를 -78 °C로 유지되는 냉동 장치에 연결하고 -80 °C에서 무기한 보관하십시오.
10. 동결건조된 펩타이드를 사용하여 실험을 위해 아세토니트릴, DMF 및 분석 등급 물의 혼합물에 1mM의 원액을 1:1:1로 준비합니다. 이 용액은 펩타이드가 응집되지 않기 때문에 최소 6개월 동안 보관할 수 있습니다.

2. 사출 혼합물의 준비

1. 동결건조된 펩타이드를 희석하기 위해 인산염 완충 식염수(PBS)(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7.4)를 준비합니다.
2. 펩타이드를 PBS에서 최종 농도 20μM로 용해시킵니다. 이 솔루션을 새로 준비하십시오. 잘 섞어 주사할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 용액에서 응집을 방지하기 위해 30분을 초과하지 마십시오.

3. 마취

1. 순환 시스템의 일반 생선 물에 마취제인 0.1% 에틸-m-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(MESAB)의 원액을 준비합니다. 마취액을 최종 농도 0.0025%(v/v)로 준비합니다.
2. 원하는 수의 물고기를 수조에서 5L의 시스템 물이 담긴 운송 용기로 꺼냅니다.
3. 플라스틱 페트리 접시(90mm)에 40mL 마취제를 반쯤 채웁니다. 이 접시를 주사에 사용하십시오.
4. 수술 운동이 멈출 때까지 마취제에서 물고기를 배양합니다.

4. 대뇌 미세 주입

1. 주입 장치의 준비
   1. 다음과 같은 매개 변수를 가진 니들 풀러를 사용하여 유리 주입 모세관을 준비합니다 : 가열 사이클, 537; 당기는 사이클, 250; 속도, 1.5 초; 시간, 80 ms.
   2. 압력 소스의 압력 설정을 25psi로 가져옵니다.
   3. 마이크로인젝터 매개변수를 홀드의 경우 20psi, 배출의 경우 10psi, 주기의 경우 2.5psi, 게이팅의 경우 100ms로 설정합니다.
   4. 유리 모세관에 주입 용액을 로드합니다. 유리 모세관을 미세 주입 홀더에 삽입합니다. 사출 각도를 45°로 조정합니다.
2. 마취액으로 채워진 새 페트리 접시에 생선 한 마리를 넣습니다.
3. 집게로 물고기를 잡고 주사 방향을 잡습니다.
4. 두개골에 있는 30G 바늘 끝을 사용하여 두 개의 측판이 만나는 시구조 위의 슬릿을 생성합니다. 팁을 뇌 조직에 삽입하지 마십시오., 출혈 및 손상을 유발할 수 있습니다.
5. 유리 모세관을 슬릿에 삽입합니다.
   1. 바늘 끝만 사용하고 두개골을 통해 1mm 이상 관통하지 마십시오. 물고기를 계속 잡고 절개 부위를 통해 유리 모세관 끝을 삽입합니다.
   2. 유리 모세관의 끝을 45° 각도로 텔렌스팔론 쪽으로 향하게 합니다. 용액 1μL를 주입합니다. 액체는 주입 직후 분산됩니다.

5. 회복

1. 물고기가 회복될 때까지 운송 용기에 다시 넣으십시오. 최적의 수질을 보장하기 위해 정기적으로 순환하는 물고기 물에 용기를 연결하십시오.
   메모: 복구에는 일반적으로 1분이 소요됩니다. 시간이 더 오래 걸리면 물고기를 더 짧은 시간 동안 마취제에 보관해야 합니다(실험자는 이를 최적화해야 합니다).

결과

표 1: Aβ42와 TR-Aβ42 펩티드 순서.

펩타이드	펩타이드 서열	MW (g/몰)
Aβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	5919.8

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
FMOC 보호 아미노산	IRIS Biotech GmbH (독일 마르크트레드비츠)		고체상 펩타이드 합성을 위한 Fmoc 기반 아미노산(SPPS)
N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)육불화우로인산우로늄(HBTU)	IRIS Biotech GmbH (독일 마르크트레드비츠)	RL-1030	활성
옥시마	IRIS Biotech GmbH (독일 마르크트레드비츠)	RL-1180	Racemization 억제제
N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민	IRIS Biotech GmbH (독일 마르크트레드비츠)	솔-003	기지
디메틸포름아미드	IRIS Biotech GmbH (독일 마르크트레드비츠)	솔-004	용매
N-메틸모르폴린	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, 독일	A12158	기지
1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (미국 미주리주 세인트루이스)	157260 알드리치	활성
피페리딘	MERCK KGaA (독일 다름슈타트)	822299	Fmoc 탈보호제 시약
디클로르메탄(DCM)	MERCK KGaA (독일 다름슈타트)	106050	용매
포름산(FA)	MERCK KGaA (독일 다름슈타트)	100264	HPLC용 완충액 성분
트리플루오로아세트산(TFA)	MERCK KGaA (독일 다름슈타트)	808260	Clevage 혼합물 시약
트리이소프로필실란(TIS)	MERCK KGaA (독일 다름슈타트)	233781 알드리치	Clevage 혼합물 시약
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디티오트리톨(DTT)	VWR International Ltd, 영국	0281-25지	Clevage 혼합물 시약
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PolymerX, 비드 크기 10μm, 250x10 mm	Phenomenex Ltd. 독일	00G-4328-N0	다공성 폴리스티렌 디비닐벤젠 HPLC 컬럼
Milli-Q Advantage A10, Milli-Q 필터 포함	EMD Millipore Corporation, 미국 매사추세츠주 빌레리카	LCPAK0001	정수 시스템
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